金銀花中肌醇的復合酶法提取及抗氧化活性評價

馬瀟瀟，田成，向福，2*，艾勇泉

（1.黃岡師范學院經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.湖北省中科產業技術研究院，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicerae japonica Thunb.），屬忍冬科又名忍冬，以其干燥花蕾或帶初開的花入藥，含綠原酸、木犀草苷、肌醇、皂甙、鞣質等生物活性物質[1-2]。大別山具有豐富的金銀花資源，“羅田金銀花”被批準為中國國家地理標志產品，因此科學利用好本地的金銀花資源具有現實意義。

肌醇是維生素B族中的一種，與維生素有類似的功能，可用于治療各種維生素缺乏癥[3]；而且能促進肝中脂肪的代謝，臨床上用于治療肝硬化、脂肪肝、肝炎等疾病[4]；同時還能降低血液中膽固醇含量[5]。作為生長因子，肌醇可用于多種菌種的培養并且具有促進酵母生長等作用[6]。在食品工業，肌醇作為食品營養強化劑具有抗氧化、抗衰老等功效[7-9]。目前，全球肌醇消耗量約為3 600 t，我國肌醇產量為1 600 t，約90%用于出口[10]。

肌醇制備主要有菲汀法[11]、化學合成法[12]、微生物法[13]、電滲析法[14]等方法。這些方法中有的工藝路線比較復雜，對設備要求較高、能量消耗高，隨之消費也比較高；還有一些方法在生產過程中，需要使用大量的酸、堿溶液，對環境造成了不可逆污染，致使處理“三廢”的費用增加[15]。因此，面對日益增長的應用需求，探討從天然植物中制備肌醇的安全加工工藝具有應用價值。

酶能溫和高效地降解植物細胞壁，酶法提取不會破壞物質活性，且副產物少，實用安全。其中，纖維素酶能破壞金銀花細胞壁，使活性物質從細胞中釋放出來[16]。半纖維素酶能夠水解與肌醇相連的半纖維素，有利于肌醇的浸出。本試驗利用纖維素酶和半纖維素酶協同，探討羅田金銀花中肌醇的酶法提取工藝，從而為大別山金銀花資源的科學利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅田金銀花：羅田縣塔山，自然陰干，粉碎過80目篩備用；肌醇標準品（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；維生素C標準品（色譜純）：武漢睿辰標物科技有限公司；纖維素酶（1 800 U/ng）、半纖維素酶（200 000 U/g）：上海金穗生物科技有限公司；高氯酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；九水硝酸鐵（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；總抗氧化試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

CP413電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DEKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠；UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司；DHG-9147A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-500DB型臺式數控超聲波清洗器：東莞市科橋超聲波設備有限公司；GL-21M醫用離心機：湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌醇標準曲線及提取率測定

根據文獻[17-19]，精確稱取肌醇標準品100 mg，用超純水溶解配制1 g/L的肌醇標準品母液。取2 mL母液于 100 mL 容量瓶中，加 0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超純水定容至刻度線，以超純水作空白對照，在200 nm～800 nm處掃描，確定最大吸收波長為201 nm。

精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 標準母液置于7個10 mL的容量瓶中，加0.05%Fe（NO3）3溶液（用1%HClO4配制）2 mL，用超純水定容至刻度線，配制成肌醇濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/L 的標準溶液，以超純水作空白，在201 nm波長下測吸光度，除去0.7 g/L濃度，得到肌醇標準曲線回歸方程為A=1.492 9C+0.02，R2=0.999，A表示吸光度，C表示肌醇質量濃度，結果表明肌醇質量濃度在0.1 g/L～0.6 g/L范圍內與吸光值線性關系良好。并按下式計算金銀花中肌醇提取率。

式中：Y為肌醇提取率，%；C為樣品中肌醇質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；M為金銀花粉末的質量，g；V為提取液體積，mL。

1.3.2 精密度試驗

取肌醇標準母液5 mL于10 mL容量瓶，加0.05%Fe（NO3）3溶液 2 mL，用超純水定容至刻度線，以超純水作空白，以最大吸收波長201 nm處測吸光度，并計算其肌醇含量。平行5次，求平均值及相對標準偏差。

1.3.3 加樣回收率

根據文獻[20]方法，取8個50 mL容量瓶，分4組。每組容量瓶中各準確加入0.1 mL肌醇提取液，分別加入肌醇標準母液 0（1～2號試管）、3 mL（3～4號試管）、5 mL（5～6號試管）、7 mL（7～8號試管），然后用超純水定容至50 mL，于201 nm下測其吸光值，并計算其肌醇含量。

1.3.4 單因素試驗

平行稱取3份金銀花粉末5 g分別置于圓底燒瓶中，加入適量的纖維素酶和半纖維素酶，按照1∶20（g/mL）料液比加入 100 mL 超純水，攪拌均勻，置于恒溫水浴鍋中酶解一段時間后放入沸水浴鍋中滅酶10 min后，冷卻到50℃～60℃左右抽濾，定容制得肌醇提取液。考察復合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質量比（5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2）、復合酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解時間（60、90、120、150、180 min）、酶解溫度（40、45、50、55、60、65℃）對金銀花肌醇提取率的影響。

1.3.5 正交優化試驗

根據單因素試驗結果，選取對金銀花中肌醇提取率影響較為顯著的復合酶質量比、復合酶添加量和酶解時間3個因素，進行正交試驗設計，正交試驗因素和水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and level

1.3.6 總抗氧化能力檢測試驗

根據文獻方法[21-22]，分別加入 2、4、6、8、10 mL 肌醇提取液于10 mL容量瓶，超純水定容至刻度線，得到系列肌醇樣液。以VC為陽性對照，根據總抗氧化試劑盒說明書操作，將測試管和對照管中樣液在520 nm波長處測定吸光度，并按下式計算其總抗氧化能力。

式中：T為總抗氧化能力，U/mL；As為測定管吸光度；Ac為對照管吸光度；V為反應液總體積，mL；Vt為取樣量，mL；n為稀釋倍數。

1.4 數據處理

利用正交設計助手II（v.3.1）和Microsoft Excel 2010等軟件完成試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

精密度試驗的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.4%，加樣回收率試驗的RSD為1.7%，且加樣回收率在98.3%～103.1%之間，表明試驗所用的測量儀器精密度良好，檢測方法可靠。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 復合酶添加量對肌醇提取率的影響

按照纖維素酶和半纖維素酶質量比1∶1，料液比1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于 60 ℃恒溫水浴鍋中酶解120 min，根據1.3.4的方法考察復合酶添加量對金銀花中肌醇提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1 復合酶添加量對肌醇提取率的影響Fig.1 Effect of the amount of multi-enzyme on the extraction rate of inositol

由圖1可知，肌醇提取率隨復合酶添加量的增加呈現先升后降趨勢，當復合酶添加量為1.0%時，提取率最高，為1.94%；繼續增加復合酶量，提取率則下降。這可能是因為復合酶量增加到一定時，酶分子過于飽和，一部分酶不能與底物結合，使得酶水解細胞壁的速度變慢，并且太多的酶具有黏附性，能夠阻塞肌醇的溶出，導致提取率下降[23]。因此，不考慮其他因素的情況下，復合酶添加量以1.0%為宜。

2.2.2 復合酶質量比對肌醇提取率的影響

按照復合酶添加量1.0%，料液比1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于60℃恒溫水浴鍋中酶解120 min，根據1.3.4的方法考察纖維素酶和半纖維素酶質量比對金銀花中肌醇提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 復合酶質量比對肌醇提取率的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of multi-enzyme on the extraction rate of inositol

由圖2中可知，肌醇提取率隨著纖維素酶與半纖維素酶質量比的變化呈現明顯的先增后減趨勢，在復合酶質量比2∶1時達到最高，此時肌醇提取率為1.96%。其中復合酶質量比 4∶1、2∶1、1∶1 對肌醇提取率的影響均不明顯，當復合酶質量比為1∶2時肌醇提取率明顯下降。纖維素酶能破壞金銀花細胞壁，使肌醇便于從細胞中釋放出來，半纖維素酶能夠水解與肌醇相連的半纖維素，有利于肌醇的浸出。因此，復合酶（纖維素酶∶半纖維素酶）質量比以2∶1為宜。

2.2.3 酶解溫度對肌醇提取率的影響

按照復合酶添加量1.0%，纖維素酶和半纖維素酶的質量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，酶解120 min，根據1.3.4的方法考察酶解溫度對金銀花中肌醇提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對肌醇提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of inositol

由圖3中可知，酶解溫度由40℃升到60℃時，肌醇提取率逐漸增加，最高為1.94%；升溫至65℃時，提取率則顯著降低。這可能是隨著酶解溫度的升高，擴散速度加快，復合酶分子活性增加，同時復合酶與底物的碰撞速率也加快了，使得復合酶水解細胞壁的反應速率加快，提取率增加[24]。當溫度升高至65℃，肌醇提取率急劇下降，則是由于溫度升高導致酶分子的空間結構發生了變化，大部分復合酶失活所致。因此，酶解溫度以60℃為宜。

2.2.4 酶解時間對肌醇提取率的影響

按照復合酶添加量1.0%，纖維素酶和半纖維素酶的質量比 1∶1，料液比 1∶20（g/mL）加入超純水，攪拌均勻，置于60℃恒溫水浴鍋中酶解，根據1.3.4的方法考察酶解時間對金銀花中肌醇提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 酶解時間對肌醇提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of inositol

由圖4可知，當酶解時間從60 min增加到90 min時，肌醇提取率迅速增加到最大值，為1.95%。隨著酶解時間延長至150 min，提取率略有下降但不明顯；當酶解時間增加到180 min時，提取率則明顯降低。因此，酶解時間對肌醇提取影響明顯，考慮實際操作成本，以90 min為宜。

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，固定酶解溫度為60℃，以肌醇提取率為評價指標，選取酶解時間（A）、復合酶添加量（B）、復合酶質量比（C）為自變量，設計L9（34）肌醇提取工藝正交優化試驗，結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 肌醇提取工藝優化試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal test for inositol extraction

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis and variance of orthogonal test

由表2、表3可知，酶解時間對肌醇提取率影響最大，其次為復合酶添加量，復合酶質量比影響最小；優化工藝條件為A2B3C3，即酶解時間90 min、復合酶添加量1.5%、復合酶質量比為1∶1。

2.4 驗證試驗

根據預測的優化條件，按復合酶質量比為1∶1，復合酶添加量1.5%，酶解時間90 min，根據1.3.4的方法，平行測定 5次，得肌醇提取率為（1.99±0.02）%，高于表2中最大提取率1.96%。

2.5 總抗氧化能力評價

依據1.3.1測得優化工藝所得金銀花提取液肌醇濃度為（0.99±0.01）g/L；根據1.3.6的方法，制得肌醇質量濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的稀釋液，并以相同濃度VC為陽性對照，計算各溶液的總抗氧化能力，結果如圖5所示。

圖5 肌醇和VC的總抗氧化能力Fig.5 The total antioxidant capacity of inositol and VC

由圖5可知，肌醇和VC的總抗氧化能力變化趨勢一致，在0.2 g/L～0.6 g/L濃度范圍內線性增長關系明顯，0.6 g/L時達到峰值，分別為（5.31±0.10）U/mL和（41.38±0.35）U/mL；繼續增加濃度則趨于穩定。相同質量濃度肌醇的總抗氧化能力相當于VC的10.0%～12.8%。

3 結論

本試驗以羅田金銀花為材料，利用正交試驗優化金銀花中肌醇的纖維素酶和半纖維素酶協同提取工藝，即復合酶質量比1∶1、復合酶添加量1.5%、料液比1∶20（g/mL），60℃酶解 90 min，肌醇提取率為 1.99%，其總抗氧化能力為相同質量濃度VC的10.0%～12.8%。該工藝條件溫和，簡單可行，可用于金銀花中肌醇提取物的工業化制備。