超聲波輔助提取紅棗中黃酮類物質的研究

劉秀敏，單春會，2，張雪，劉婭，3*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000；3.新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000）

紅棗系鼠李科植物的果實，自古以來與桃、李、杏、栗并稱“中國五果”[1]，其富含糖類、膳食纖維、蛋白質、維生素等多種營養成分及黃酮、多酚、多糖、皂苷等生物活性成分[2]，是一種天然的藥食同源食品[3]。已有研究表明黃酮類化合物是最具活性的天然產物之一[4]，對人體生命健康起著重要作用[5]，具有抗病毒、抗過敏、降血脂、預防心腦血管疾病、抗菌消炎等功效[6-8]。

目前黃酮類物質主要以甲醇、乙醇和乙酸乙酯等有機溶劑提取，工藝要求苛刻，高溫條件和大量有機溶劑的使用使得黃酮類化合物易發生電離、水解和氧化而失活[9]，有毒有機溶劑的使用還會導致環境問題并增加人類健康風險[10]。低共熔溶劑（deep eutectic sol－vent，DES）作為一種新型綠色提取溶劑，因具有原料易得、無毒性、成本低、可生物降解且能精準調節和設計等優勢[11-14]，目前已經成功用于黃酮[15]、酚酸[16]、花青素[17]、多酚[18]、多糖[19]等多種生物活性成分的提取。因此，本文針對新疆豐富的紅棗資源，輔以高效的超聲波技術，利用低共熔溶劑提取紅棗中的黃酮類物質，旨在提高紅棗的附加值，為新疆紅棗產業的綠色可持續發展提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗：產自新疆石河子；氯化膽堿、蘆丁標準品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；尿素、氫氧化鈉：天津市化學試劑三廠；亞硝酸鈉：天津市巴斯夫化工有限公司；硝酸鋁：天津市北聯精細化學品開發有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-20G-Ⅱ高速離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；JP-1000B-2高速多功能粉碎機：永康市永久工貿有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；WD-2102A酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；SK5200BT超聲清洗器：上海科導超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低共熔溶劑的配制

按照一定的摩爾比稱取氯化膽堿和尿素，加入一定量的蒸餾水。用磁力攪拌器攪拌，直至形成均勻透明的液體，冷卻至室溫25℃備用[20]。

1.3.2 紅棗中黃酮的提取

將紅棗片粉碎過40目篩，4℃冷藏備用。稱取一定質量的紅棗粉，按照一定料液比與DES均勻混合，進行超聲波輔助提取（200 W，35 kHz），然后以6 000 r/min離心10 min，取上清液即為紅棗黃酮提取液。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取0.5 g紅棗粉，分別考察低共熔溶劑（氯化膽堿∶尿素）的摩爾比（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）、加水量（10%、20%、30%、50%、70%、90%）、料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）]、超聲溫度（45、50、55、60、65、70 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）對黃酮得率及總還原力的影響。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以加水量、料液比、超聲溫度、超聲時間4個因素為自變量，黃酮得率（Y）為響應值，利用Box-Behnken設計四因素三水平的試驗[21]，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 黃酮含量測定和黃酮得率的計算

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定黃酮含量[22]。精密稱取蘆丁對照品，用60%乙醇配制成0.10 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別準確吸取標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 支 10 mL 具塞刻度試管中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min；再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，然后加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加蒸餾水定容至10 mL，搖勻后靜置15 min。在510 nm波長下測其吸光度，根據蘆丁濃度和吸光度繪制標準曲線。黃酮測定方法為取1 mL樣品溶液至10 mL具塞刻度試管中，后續操作按照標準曲線方法進行，黃酮得率計算公式如下。

式中：X為將測得吸光值代入標曲后計算得出的黃酮質量濃度，mg/mL；V0為提取液定容后的體積，mL；V1為測吸光值時所用提取液的體積，mL；V2為待測提取液總體積，mL；m為紅棗粉質量，g；W為黃酮得率，mg/g。

1.3.6 總還原力測定

參照文獻[23]的方法測定總還原力。分別取濃度為0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL 樣品溶液 1.0 mL，分別加入0.2 mol/L（pH 6.6）的磷酸鹽緩沖溶液（phos phatebuffersaline，PBS）0.2mL和1%氰化鉀溶液 0.5mL，搖勻后置于50℃水浴中反應20 min，反應結束后用流動水迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL終止反應。然后在5 000 r/min下離心10 min，取1.5 mL上清液于試管中，加入1%三氯化鐵溶液0.2 mL和蒸餾水3 mL，搖勻后靜置8 min，在700 nm處測定吸光度，平行測定3次，取平均值，以VC作陽性對照。吸光值越大則代表樣品還原能力越強。

1.4 數據處理

采用Origin8.5軟件做圖，Design-Expert 8.0.6軟件進行方差顯著性處理和分析，測定數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 氯化膽堿與尿素的摩爾比對黃酮得率的影響

氯化膽堿與尿素的摩爾比對黃酮得率的影響見圖1。

圖1 氯化膽堿與尿素的摩爾比對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of molar ratio of choline chloride to urea on the yield of flavonoids

由圖1可以看出，當DES體系中的氫鍵受體氯化膽堿與氫鍵供體尿素的摩爾比為2∶1，此時黃酮得率最高。這可能是因為DES體系是一種弱堿性溶液，DES的pH值可通過影響DES與溶質分子之間的靜電鍵和氫鍵相互作用而在提取中起重要作用。由于存在酚羥基，黃酮類化合物通常具有弱酸性，也增加一定溶解能力。當DES組分摩爾比改變時，會極大影響體系極性、pH值、黏度、密度、折光率等理化性質[24]，從而影響黃酮提取效率。因此選擇氯化膽堿與尿素的摩爾比為2∶1進行后續研究。

2.1.2 DES的加水量對黃酮得率的影響

DES的加水量對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 加水量對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of adding water on the yield of flavonoids

由圖2可知，加水量對黃酮得率影響很大，DES加水量為50%時黃酮得率最高。加水量低于50%時，黃酮得率隨加水量增加呈現上升趨勢，可能是因為氯化膽堿與尿素構建的DES體系在室溫25℃下具有很高黏度（428 mPa·s）[10]，而加水量增加至 50%，體系黏度顯著降低[25]，大大提高了DES溶液的傳質效率，從而提高黃酮得率。加水量高于50%后，會增加DES的極性，而極性的增加不利于黃酮類物質提取，因此得率明顯下降。

2.1.3 料液比對黃酮得率的影響

料液比對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 不同料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖3可知，隨著溶劑用量的增加，黃酮得率呈上升趨勢。提取溶劑用量的增加，會加大紅棗粉與提取劑的接觸面積，從而加快紅棗粉中黃酮向提取溶劑的質量轉移，從而提高得率。料液比從1∶35（g/mL）至1∶40（g/mL）時，得率增加速率顯著下降，這可能是因為提取溶劑的增多反而起到了稀釋作用，并且增加其它物質的析出，影響得率。因此從經濟節約的角度選擇料液比 1∶35（g/mL）進行后續研究。

2.1.4 超聲溫度對黃酮得率的影響

超聲溫度對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 不同超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic temperature on the yield of flavonoids

由圖4可知，黃酮得率隨著超聲溫度的升高而增大。升高溫度，會降低DES體系的黏度，增加紅棗粉的分散性，加速溶質的傳質作用，有利于有效成分的析出[25]。溫度的升高雖有利于黃酮的提取，但高溫也會破壞黃酮類化合物的活性，使其氧化、水解、電離[9]。因此從經濟節約的角度選擇超聲溫度為65℃進行后續研究。

2.1.5 超聲時間對黃酮得率的影響

超聲時間對黃酮得率的影響見圖5。

圖5 不同超聲時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the yield of flavonoids

隨著超聲時間的增加，黃酮得率呈上升趨勢，這是由于超聲波的空化效應和機械效應，能夠增大物質分子運動頻率和速度，從而加速溶質的擴散和傳播，使有效成分易溶出。從圖5可知，超聲時間從40 min增至60 min時，上升速率明顯下降，其原因可能是超聲時間過長，樣品組織中其它物質會擴散出來，并附著于樣品表面，阻礙樣品與溶劑接觸，從而影響提取效率。因此選擇超聲時間50 min為宜。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

以單因素試驗結果為基礎，設計響應面優化試驗。響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface experiment results

續表2 響應面試驗結果Continue table 2 Response surface experiment results

利用Design-Expert 8.0.6軟件，對試驗數據進行多元回歸模型擬合，得到回歸方程：Y=5.63-0.083A+0.10B+0.19C-8.061×103D+0.053AB-0.16AC+0.18AD+0.15BC+0.058BD-0.12CD-0.42A2-0.11B2-0.068C2-0.041D2。對回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析。

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface regression model

由表 3可知，模型相關系數 R2=0.959 4，P＜0.01，說明該響應面模型極顯著，模型能解釋95.94%響應值的變化，模型擬合程度較好。且失擬項為0.073 0不顯著（P＞0.05）。模型R2Adj=0.918 7，說明不確定因素對試驗結果干擾較小，僅有總變異的8.13%不能用此模型解釋。一次項 A、B、C 影響極顯著（P＜0.01）；交互項 AC、BC、CD 影響極顯著（P＜0.01）；A2、B2影響極顯著（P＜0.01），C2影響顯著（P＜0.05）。根據 F 值可知各因素對黃酮得率影響程度的大小順序為超聲溫度＞料液比＞加水量＞超聲時間。

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用響應面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing the mutual effects of different factors

響應面曲面圖的曲面越陡峭，說明該因素對黃酮得率影響越大。由圖6可明顯看出，A（加水量）及 C（超聲溫度）、B（料液比）及 C（超聲溫度）、C（超聲溫度）及D（超聲時間）的交互作用的曲面有較大的傾斜度，說明這些交互項對紅棗黃酮得率影響較大。

2.2.3 驗證試驗

根據優化得出的最佳條件為加水量45.28%，料液比 1∶40（g/mL），超聲溫度 69.99 ℃，超聲時間 43.92 min。考慮到操作條件的可行性，最終將試驗條件調整為加水量 45%，料液比 1∶40（g/mL），超聲溫度 70 ℃，超聲時間44 min，進行回歸模型有效性驗證，此時黃酮得率為5.79 mg/g，該值和理論值（5.95 mg/g）基本一致，表明采用Box-Behnken分析法優化紅棗中黃酮的提取工藝可行。

2.3 總還原力的測定結果

總還原力的測定結果見圖7。

圖7 紅棗黃酮總還原力的變化Fig.7 Changes of total reduction ability of jujube flavonoids

由圖7可知，不同質量濃度的紅棗黃酮均表現出一定的總還原力，且總還原力隨其質量濃度的增大而增強。總體VC還原力比樣品總還原力要強，其主要原因是作為陽性對照的VC為純品，而本文提取得到的僅為粗品黃酮，并未進一步分離純化。但仍可以發現，紅棗中的黃酮具有較好的還原能力。

3 結論

本文以紅棗為研究對象，以氯化膽堿與尿素構建的DES為提取溶劑，研究氯化膽堿與尿素的摩爾比、加水量、料液比、超聲溫度、超聲時間對紅棗中的黃酮得率及總還原力的影響。通過響應面優化試驗確定黃酮提取的最佳工藝參數：氯化膽堿與尿素摩爾比為2∶1，加水量 45%，料液比 1∶40（g/mL），超聲溫度 70 ℃，超聲時間44 min，此時黃酮得率為5.79 mg/g。紅棗中黃酮的總還原力隨濃度增加而增大，紅棗黃酮粗提液具有較好還原力。