陰離子固相萃取-HPLC法測定肉制品中13種合成色素

李道霞，黃麗娟，唐昌云，蔣燕舒，余曉琴

（四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 611731）

我國各級食品抽檢信息發布中，肉制品中常見合成色素不合格情況主要是GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中收錄的食品添加劑[1]，如胭脂紅、檸檬黃、日落黃等[2]。隨著監管和監測的力度加大，發現市場上一些肉制品存在添加工業染料的情況，如酸性橙II[3]、紅2G[4-5]。近年來有少數文獻報道肉制品紅2G[6-7]的檢出情況。本試驗結合信息發布、文獻報道和實驗室篩查等，以肉制品中易于濫用的合成色素為研究對象，盡量同時覆蓋多種易于濫用的目標化合物，建立同時檢測多種合成色素的方法以實現高通量檢測和監管。

合成色素檢測的前處理方法有聚酰胺吸附法[8-9]、液-液萃取法[10-11]和固相萃取法等[12-13]。現行國標GB 5009.35—2016《食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定》和GB/T 9695.6—2008《肉制品胭脂紅著色劑測定》均采用聚酰胺粉末吸附法[14-15]，該方法中以聚酰胺粉末吸附著色劑，再經G3垂融漏斗進行抽濾洗脫，整個過程耗時且不利于批量操作，適用基質范圍窄，可同時測定的色素少。紅2G目前還沒有發布檢測標準或食品補充檢驗方法。另外，肉制品中通常含有大量脂肪和蛋白質，采用上述標準檢測合成色素時，凈化效果不理想，回收率偏低。因此，十分有必要建立一種能有效解決高脂肪、高蛋白樣品的批量提取及凈化，并同時測定多種合成色素的方法。

固相萃取技術因其操作簡便、快速和重復性好等優點已成為復雜樣品批量凈化的有效手段，主要分為陽離子固相萃取和陰離子固相萃取[16]。大部分合成色素含有磺酸基、酚羥基及羧基等陰離子基團[17-18]，可用陰離子固相小柱凈化處理[19-20]。本研究采用陰離子交換固相萃取法，重點對除脂溶劑、除蛋白質方法等進行優化，建立陰離子固相萃取-高效液相色譜法同時測定肉制品中13種合成色素的檢測方法。為肉制品中合成色素濫用的監測提供一種更加快速、簡便的檢測方法，同時也為其它高脂肪、高蛋白食品基質（如水產制品、豆制品等）中多種色素的監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉制品基質：醬鹵肉制品（鹵豬肉）、腌臘肉制品（臘豬肉）、熏煮香腸火腿制品（火腿腸）、熟肉干制品（牛肉干）。肉制品樣本共計156批，來源于各類超市及菜市場，包含醬鹵肉制品類（63批）、腌臘肉制品類（63批）、熟肉干制品（15批）及熏煮香腸火腿制品（15批）。

乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純）：德國默克公司；乙腈、甲醇、無水乙醇、石油醚（沸程30℃～60℃）、正己烷、無水乙醚、甲酸、氨水（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；試驗用水均為超純水（GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水）；檸檬黃、新紅、莧菜紅、喹啉黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅2G、酸性紅、靛藍、亮藍、赤蘚紅及酸性橙Ⅱ標準品（純度≥85%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；Cleanert PWAX固相小柱（150 mg/6 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司；Oasis WAX固相小柱（150 mg/6 mL）：美國Waters公司；WondaSep WAX固相小柱（150 mg/6 mL）：日本島津公司。

1.2 儀器與設備

UltiMate 3000高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）：美國Thermo Fisher Scientific公司；XBridge Shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）：美國Waters公司；IKA?MS 3漩渦振動器：德國IKA公司。Milli-Q高純水發生器：美國Millipore公司；Heraeus Multifuge X3R冷凍離心機：德國SIGMA公司；N1-50氮吹儀：中國杭州奧盛科學儀器有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司；濾膜（0.22 μm）：上海標卓科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取按其純度折算為100%質量的標準品各10 mg，用水配制質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，4℃保存。分別取各化合物的儲備液適量用20 mmol/L乙酸銨配制成混合標準溶液，現用現配。

1.3.2 樣品前處理

取樣品2.0 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL石油醚（沸程30℃～60℃），渦旋1 min，超聲輔助提取10 min，8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘渣氮氣吹至無石油醚味，加入20 mL乙醇氨水溶液（無水乙醇∶2%氨水溶液∶水=7∶2∶1，體積比），渦旋 1 min，超聲輔助提取10 min，8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL容量瓶中，殘渣加入15 mL乙醇氨水溶液重復提取1次，合并上清液，用乙醇氨水溶液定容至刻度，混勻即得提取液。將提取液轉移至50 mL離心管后于-40℃冷凍1 h，取出放至室溫（25℃），8 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液10 mL，70℃下氮吹濃縮至約2 mL，分2次加入10 mL 5%甲醇水溶液溶解殘渣，作為待凈化液。

將待凈化液以1 mL/min的速度過陰離子固相小柱（使用前經6 mL甲醇活化，6 mL水平衡），待凈化液全部流出后，依次用6 mL水、6 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，用6 mL 2%的氨化甲醇溶液洗脫，收集全部洗脫液，在60℃水浴條件下氮氣吹干，殘渣用2 mL乙酸銨溶液（20 mmol/L，pH=9）溶解，經 0.22 μm 水系微孔濾膜過濾后供高效液相色譜儀檢測分析。

1.3.3 色譜檢測條件

色譜柱：Waters XBridge Shield RP18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相A為20 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min，5%～30%B；5 min～7 min，30%～35%B；7 min～12 min，35%～85%B；12 min～15 min，85%B；15 min～16 min，85%～5%B；16 min～18 min，5%B；流速 0.8 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量10 μL。采集13種合成色素在200 nm～700 nm波長范圍內的吸收光譜圖，在415、510 nm及610 nm下進行定量檢測（其中喹啉黃、亮藍對照品均為多個色譜峰，定量計算時以多個峰面積之和計）。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇及優化

本研究以甲醇和20 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相系統，分別考察了Waters XBridge Shield RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和 Waters Sunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），其中 Waters XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對新紅和莧菜紅的分離度稍差，但通過對流動相梯度進行調整后，4種色譜柱均能滿足分離要求。13種色素在Waters XBridge Shield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）上的出峰順序如圖1。

1933年12月14日、22日，全總蘇區中央執行局委員長劉少奇先后給梁廣、郭光洲（時任全總蘇區中央執行局青工部代部長）及朱榮生、王子剛寫信，就他們寫給全總執行局的報告、來信反映的工作情況和思想認識，進行批評指導。這兩封信后來以《反對擴大紅軍突擊運動中的機會主義的動搖》為題，發表在中共中央機關刊物《斗爭》第41期（1934年1月5日出刊）。

圖1 13種合成色素的標準色譜圖Fig.1 Standard chromatograms of 13 synthetic colorants

2.2 檢測波長選擇

13種著色劑在200 nm～700 nm波長范圍內的吸收均呈現雙峰，一個吸收峰在254 nm左右，另一個吸收峰在可見光區。大部分有機化合物在254 nm下有吸收，因此將檢測波長選擇在可見光區的吸收峰處，有助于屏蔽基質中的干擾。綜合著色劑的吸收情況最終選擇的檢測波長為：檸檬黃、喹啉黃為415 nm；新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅2G、酸性紅、赤蘚紅、酸性橙Ⅱ為510 nm；亮藍、靛藍為610 nm。

2.3 除脂肪溶劑選擇

肉制品中通常含有大量油脂，其存在會影響著色劑的提取，且在凈化過程中易堵塞固相小柱，因此需在前處理過程中去除油脂。石油醚、正己烷及無水乙醚均可用于除去食品中的脂肪，研究分別考察了3種除脂溶劑對肉制品中13種色素提取的影響。結果見圖2。

圖2 除脂溶劑對13種色素回收率的影響（n=6）Fig.2 Effects of fat removal solvents on the recovery of 13 colorants（n=6）

如圖2所示，3種除脂溶劑對大部分色素檢測的影響無明顯差異，但經石油醚除脂后新紅、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅及靛藍的回收率均明顯高于另外兩種除脂溶劑；且乙醚微溶于水，當樣品中含水量較高時，不宜用無水乙醚除脂；而正己烷沸點為69℃，除脂后揮去殘留溶劑的時間較長。綜合考慮對回收率的影響及前處理時長等因素，采用石油醚作為除脂肪溶劑。

2.4 蛋白質沉淀方法優化

肉制品中含有的蛋白質，經提取濃縮后易堵塞固相小柱，從而影響色素與固相小柱官能團的結合，且部分蛋白質含有陰離子基團，會和目標化合物競爭結合位點，因此對沉淀蛋白質的方法進行了優化。研究采用鎢酸鈉、醋酸鉛、亞鐵氰化鉀等進行蛋白沉淀時，赤蘚紅、酸性紅、紅2G等大部分紅色系色素因吸附于蛋白沉淀表面而導致回收率偏低，且重現性較差。而通過低溫冷凍方式降低蛋白溶解度能夠有效沉淀蛋白，因此分別考察醬鹵肉制品5 mg/kg加標樣品提取液在-40℃下冷凍0、1、2、4 h后對13種目標化合物的影響，結果如圖3所示。

圖3 冷凍時間對13種色素回收率的影響（n=6）Fig.3 Effect of freezing time on recovery of 13 colorants（n=6）

圖3結果表明，該方法對絕大部分色素的回收率沒有顯著影響，但隨著冷凍時間延長，赤蘚紅回收率降低明顯，與冷凍1 h相比，冷凍2 h后赤蘚紅回收率降低了39.1%，冷凍4 h后赤蘚紅回收率降低了73.8%。因此，本方法采取對高蛋白樣品進行冷凍1 h沉淀蛋白。

2.5 固相萃取柱的比較

研究發現，陰離子交換固相萃取法比聚酰胺粉末吸附法更能顯著提高赤蘚紅、紅2G和酸性橙Ⅱ的回收率，因此最終選擇陰離子交換固相萃取法作為凈化方式。試驗考察了Oasis WAX（150 mg/6 mL）、Cleanert PWAX（150 mg/6 mL）及 WondaSep WAX（150 mg/6 mL）3種固相小柱的凈化效果，結果如圖4所示。

圖4 陰離子固相小柱對13種色素回收率的影響（n=6）Fig.4 Effect of anionic SPEs on recovery of 13 colorants（n=6）

圖4結果顯示新紅、莧菜紅、胭脂紅通過Cleanert PWAX凈化后回收率明顯高于另外兩種固相小柱，但3種固相小柱對其余10種化合物的凈化效果無顯著差異。因此，綜合13種化合物的凈化效果，3種陰離子固相小柱均可用于肉制品多種合成色素的測定。

2.6 固相萃取柱洗脫溶劑的優化

表1 不同濃度的氨化甲醇洗脫效果比較（n=6）Table 1 Elution effects of different ammoniated methanol（n=6）

由表1可知，1%～5%氨化甲醇對13種色素的洗脫能力有一定差異，其中靛藍和赤蘚紅回收率隨洗脫溶液堿性的變化差異最明顯，靛藍隨堿性增加回收率下降，分析原因為堿性越強，靛藍降解越快。赤蘚紅回收率均低于其余化合物，分析原因為赤蘚紅堿性條件不穩定，且赤蘚紅吸附性較強。綜合考慮各化合物的回收率及化合物穩定性，選用2%的氨化甲醇作為洗脫溶劑。

2.7 方法學驗證

2.7.1 特異性

本方法通過二極管陣列檢測器采集各化合物200 nm～700 nm范圍內的吸收圖譜，采用415、510 nm及610 nm進行定量檢測，方法特異性高。在空白樣品和加標回收樣品的色譜圖中未發現干擾峰，說明方法具有較好的選擇性。

2.7.2 線性范圍、相關系數和檢出限

用20 mmol/L乙酸銨溶液配制系列標準工作溶液，用化合物峰面積對質量濃度繪制標準曲線。各化合物在 0.1 μg/mL～10 μg/mL 范圍內線性關系良好，其線性相關系數r均高于0.999 5。以3倍和10倍信噪比分別確定方法的檢出限和定量限，結果見表2。

表2 方法的線性、相關系數、檢出限及定量限Table 2 Linearity,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitative of the method

續表2 方法的線性、相關系數、檢出限及定量限Continue table 2 Linearity,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitative of the method

2.7.3 準確度和精密度

以醬鹵肉、腌臘肉、熏煮香腸火腿制品及熟肉干制品為代表基質，分別在3個水平下進行加標回收試驗，考察方法的準確度（以加標樣品的回收率表示）和精密度（以相對標準偏差表示，RSD），結果見表3。

表3 方法的準確度和精密度（n=6）Table 3 Accuracies and precisions of the method（n=6）

續表3 方法的準確度和精密度（n=6）Continue table 3 Accuracies and precisions of the method（n=6）

由表3可知，13種色素的平均回收率為65.2%～102.0%，精密度為0.2%～5.6%，表明方法的準確度較好、精密度較高。

2.8 實際樣品測定

利用本研究建立的方法檢測156批次肉制品，其中熟肉干制品和熏煮香腸火腿制品中均未檢出目標色素，醬鹵肉制品、腌臘肉制品中分別發現4批、8批存在違規使用合成色素的情況。12批陽性樣品信息及結果如表4所示。

表4 12批樣品的測定結果Table 4 The results of 12 batches

酸性橙Ⅱ、紅2G為禁止在食品中使用的色素，由表4可知，這兩種色素的測定含量在0.23 mg/kg～9.6 mg/kg之間；酸性紅、莧菜紅和日落黃為GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規定在肉制品中不得使用的合成色素，其檢出含量范圍為4.7 mg/kg～15.7 mg/kg。測定結果表明，醬鹵肉制品及腌臘肉制品中均存在使用違禁色素和超范圍使用合成色素的情況，分析原因可能是主觀添加或使用合成色素不合格的原輔料。

3 結論

本研究建立了陰離子固相萃取-高效液相色譜同時測定肉制品中的13種色素的方法。通過優化試驗，探討除脂肪、除蛋白質、固相小柱等前處理條件，并優化色譜條件，同時對方法的回收率、檢出限及定量限等技術指標進行研究，建立了同時檢測肉制品中紅2G、酸性橙Ⅱ等13種色素的檢測方法，有效地解決了肉制品檢測過程中高脂高蛋白、批量凈化處理、同時測定多種合成色素三大關鍵問題。本研究涉及的目標化合物不僅包含了目前我國食品抽檢中監測的11種合成色素，還包括酸性橙Ⅱ和紅2G兩個禁用色素，彌補了現有檢測標準GB 5009.35—2016《食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定》和GB/T 9695.6—2008《肉制品胭脂紅著色劑測定》檢測基質范圍窄及同時測定化合物數量少等問題。本研究對市售肉制品的測定結果顯示：依據GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》，肉制品目前仍存在超范圍使用合成色素的情況，尤其是腌臘肉制品中的臘腸類制品情況相對突出；此外在肉制品中還檢出禁用合成色素紅2G和酸性橙Ⅱ，應予以關注。該方法簡便快速、準確可靠、靈敏度高、抗干擾能力強，可為制定肉制品中檸檬黃、胭脂紅、以及新發現的紅2G、酸性橙Ⅱ等多種合成色素同時測定的檢測標準提供依據，并可用于大批量肉制品中13種合成色素的日常監測分析和快速篩查。