HPLC-PDA聯合UPLC-Triple TOF MS法確證恩諾沙星注射液中的非法添加物

宋慧敏，熊 玥，汪云花，孫 瑤，石慧慧

(江蘇省獸藥飼料質量檢驗所，南京 210036)

自2008年發現第一例獸藥處方外非法添加物以來，農業農村部對獸藥處方外非法添加的監管與打擊力度不斷加大。除有針對性的出臺相關法律法規進行處罰外，還相繼發布了一系列公告作為獸藥處方外非法添加物檢查的依據[1-2]。隨著監管手段不斷加強，檢查方法日臻完善，非法添加現象大幅減少，但仍有少數商家為了搶占市場份額，謀取利益最大化，采取各種手段尋求新的非法添加物。這些物質一般不常見，無論是作為獸藥還是人用藥，早已在市場上悄聲匿跡，或才剛上市未進入公眾視野，有的甚至還在研發階段。而目前已發布的檢查方法多針對市場份額占有率較高的常用藥，或有跡可循，或可預測的藥物，這些新開發的藥物無疑為非法添加的篩查帶來了新的挑戰。目前已發布的獸藥處方外非法添加物的檢查方法主要采用HPLC-PDA法，少數采用高效液相色譜-串聯質譜法，這兩種方法均需一定數量的譜庫數據為支撐，而對于譜庫外非法添加物的識別和確證就成了非法添加工作中的難點。隨著高分辨質譜的飛速發展，UPLC-TOF MS技術已越來越多的用于非法添加未知物的篩查。近日，在做非法添加物HPLC-PDA法常規篩查時，發現一批恩諾沙星注射液中有一未知物，根據其紫外光譜特征及高分辨質譜提供的信息推測出疑似添加物，再用HPLC-PDA和UPLC-Triple TOF MS進行雙重驗證，最終確認該非法添加物為加替沙星。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters Arc 2998)，配二極管陣列檢測器(PDA2998)；超高效液相色譜儀(Shimadzu UPLC LC-30A)-四級桿/飛行時間質譜儀(SCIEX Triple TOF 4600)；分析天平(METTLER XS205)。乙腈、三乙胺、甲酸為色譜純(Merk)，水為超純水，磷酸為優級純。

1.2 試藥 加替沙星(含量97.2%)購自中國藥品生物制品檢定所；恩諾沙星(含量99.5%)購自中國獸醫藥品監察所；恩諾沙星注射液(100 mL∶2.5 g)為江蘇省內風險監測樣品。

2 方法與結果

2.1 HPLC-PDA法初篩

2.1.1 色譜條件 XBrige C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以磷酸溶液A(取磷酸3.0 mL，加水至1000 mL，用三乙胺調pH值至3.0 ± 0.1，加乙腈50 mL)-甲醇(88∶12)為流動相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；采集波長范圍為190～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄292 nm波長處的色譜圖，同時記錄光譜圖。

2.1.2 供試品溶液的制備 量取恩諾沙星注射液1.0 mL，置具塞錐形瓶中，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)50 mL，超聲處理15 min，放置至室溫，取5.0 mL，用磷酸溶液A(2.1.1項下)稀釋至50 mL，搖勻，作為HPLC-PDA 初篩用供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 稱取恩諾沙星對照品25 mg，置50 mL容量瓶中，按2.1.2項下方法操作，稀釋制成每1 mL含約50 μg的對照品溶液。

2.1.4 結果分析 取供試品溶液和對照品溶液，在2.1.1項色譜條件下分別進樣，供試品溶液色譜圖中未出現與恩諾沙星保留時間一致的色譜峰，但在30.773 min處有一未知峰。該未知峰在326、292、232 nm處有最大吸收，其紫外光譜與喹諾酮類藥物光譜特征相似，推測此峰為喹諾酮類藥物或類似物。將該光譜圖與建立的非法添加物光譜圖庫進行比對，未匹配到疑似添加物，需借助質譜做進一步分析。未知物光譜及色譜圖見圖1。

圖1 未知物光譜及色譜圖

2.2 質譜法分析

2.2.1 色譜條件 ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫(0～6 min，由90% A線性變化為10% A；6～10 min，保持10% A；10～14 min，由10% A線性變化為90% A；14～15 min，保持90% A)；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧電離(ESI)：正離子模式；噴霧電壓：5500 V；霧化氣：55 psi；加熱輔助氣：55 psi；氣簾氣：35 psi；離子源溫度：500 ℃；掃描模式：MS mode，質量范圍100～1000 Da，掃描時間100 ms；MS/MS mode，質量范圍100～1000 Da，掃描時間50 ms，去簇電壓(DP)80 V，碰撞能量(CE)35 eV，擴展碰撞能量(CES)15 eV。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻；取1.0 mL，用50%乙腈溶液稀釋至100 mL，搖勻；再取1.0 mL，用50%乙腈溶液稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.2.4 結果分析 在2.2.1項和2.2.2項條件下，采集得到未知物的二級質譜圖，利用PeakView軟件對數據進行分析處理。根據預先導入的40種喹諾酮類化合物譜庫信息，獲得未知物提取離子流(XIC)圖，對照40個化合物的TOF-MS 質量精度和同位素分布情況，以及TOF-MS/MS譜圖，得到匹配度。最終，在供試品中提取到和Gatifloxacin(加替沙星)相似的一級質譜圖，其精確質量數為376.1667，一級質譜質量偏差為0.3 ppm，母離子天然同位素比對結果良好(圖2)。另從圖譜解析的角度看，二級質譜圖(圖3)高質荷比區[M+H]+m/z376.1667離子強度最大，且和相鄰碎片里子(m/z358.1561)質荷比相差18，屬于合理丟失，推測應為未知物的分子離子峰，從而得知該未知物的分子量為375，且分子中含奇數個N原子。又從圖中同位素峰的比例看，該未知物不含Cl原子，結合PDA光譜圖知其應為恩諾沙星同類物質，推測分子中應含有F。對比40種喹諾酮類化合物，只有加替沙星符合以上所有特征，和譜庫篩選結果一致。為進一步確認篩查結果，分別用HPLC-PDA法和UPLC-Triple TOF MS法對未知物進行驗證。

圖2 母離子天然同位素圖

圖3 供試品二級質譜圖

2.3 HPLC-PDA法驗證和定量

2.3.1 供試品溶液制備 同2.1.2項下供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液制備 稱取加替沙星對照品25 mg，按2.1.2項下操作，稀釋制成每1 mL含50 μg的對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 同2.1.1項初篩色譜條件。

2.3.4 結果分析 將供試品中的未知物與加替沙星保留時間及紫外光譜圖(圖4)進行比對，以及不同濃度本底添加對供試品中的未知物進行驗證。供試品中未知色譜峰與加替沙星的保留時間一致，紫外光譜圖一致；不同濃度(取對照品溶液與供試品溶液按 1∶4、1∶1、4∶1 的比例混合)的本底添加試驗顯示，添加前后，供試品色譜峰的純度角度均小于純度閾值，可認為是單一物質峰，光譜的匹配角度均小于匹配閾值，可認為是同一化合物。驗證結果表明，供試品溶液中未知物即為加替沙星，驗證數據和結果見表1、表2。同時測得恩諾沙星注射液中非法添加加替沙星的含量為2.2%。

表1 HPLC-PDA 驗證結果

圖4 加替沙星對照品光譜指數圖

表2 峰純度與光譜相似度檢查結果

2.4 UPLC-Triple TOF MS法驗證

2.4.1 對照品溶液的制備 稱取加替沙星對照品25 mg，用50%乙腈溶液稀釋制成每1 mL含50 ng的溶液，作為對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 使用2.2.3項下供試品溶液作為確證用供試品溶液。

2.4.3 儀器條件 同2.2.1項和2.2.2項。

2.4.4 結果分析 在與供試品相同分析條件下，得到加替沙星母離子準確分子量、母離子天然同位素、二級質譜圖、保留時間四大信息，并將信息載入軟件譜庫中。將供試品中未知物的譜圖信息與加替沙星譜圖信息進行比較，得到一級質譜質量偏差為0.2 ppm, 二級譜庫匹配度為100%，保留時間基本一致，總體匹配度98%，非法添加的未知物確證為加替沙星(圖5)。為進一步增強質譜信息的可信度，對裂解規律進行了推導(圖6)。

圖5 未知物二級譜圖與加替沙星二級譜圖的匹配圖

圖6 未知物可能裂解規律

3 討 論

3.1 非法添加加替沙星合理性分析 恩諾沙星為第三代喹諾酮類藥物，收載于《中國獸藥典》2015版一部[3]，是動物專用的廣譜抗菌藥物。加替沙星為第四代喹諾酮類藥物[4]，與大多數氟喹諾酮抗菌藥相比，增強了對革蘭陽性菌及厭氧菌的抗菌作用，提高了生物利用度，從而表現出殺菌力強、選擇性高的特點。臨床上多用于呼吸、泌尿、生殖及消化系統等的感染，屬人用藥物。在恩諾沙星注射液中非法添加抗菌作用更強的加替沙星，顯然是為了片面追求療效，搶占經營市場。

3.2 非法添加物篩查及確證的一般模式 目前，獸藥制劑中非法添加物的篩查主要基于HPLC-PDA法，將未知物的光譜圖與譜庫中數據匹配，根據匹配結果，再用對照品譜圖信息進行確證。這不僅要求有一定容量的數據庫，而且對未知物的判定也僅限于庫中化合物。本文將UPLC-Triple TOF MS法與HPLC-PDA法相結合，利用高分辨質譜提供的精確質量數、同位素分布情況、二級質譜圖等信息推測出疑似添加物，再分別用兩種方法進行確認。在不具備高分辨質譜的條件下，也可利用低分辨質譜先獲取未知物一級質譜圖，根據譜圖中分子離子峰和丟失碎片離子特征，結合譜圖解析和PDA光譜圖推測可能化合物，再進行確證。

3.3 擴充數據庫的重要性 超高效液相色譜串聯飛行時間質譜不僅能測得化合物的分子式和精確分子量，同時具備完全定性、定量的特性，具有高分辨率、高靈敏度和高掃描速度等特點[5-6]。但這一切優勢都需以強大的數據庫為基礎，所以只有不斷完善、豐富化合物數據庫，才能充分發揮數據庫的優勢，發揮儀器本身的優勢，進而對可能的非法添加物進行全面的篩查和確證。

近年來，在非法添加物的篩查中，恩諾沙星制劑多檢出甲氧芐啶、苯甲酸、煙酰胺、水楊酸等非法添加物，加替沙星的檢出尚屬首次，且在其他制劑中也未曾檢出過加替沙星。說明在高壓的監管、處罰手段下，非法添加更加隱蔽，添加方式也更加多樣。希望本文能給獸藥中非法添加物檢查提供一定的方法借鑒，同時也為監督管理部門提供監管思路。