新型甘油／明膠基水凝膠在創面修復中的應用效果研究

杜林 陸雯麗 劉慶芬 顧芬

如何修復皮膚缺損、減少瘢痕形成是臨床亟待解決的問題。生物材料的進步與發展有望為解決該問題提供新思路及新策略。其中，明膠已被廣泛地應用于多個領域［1－3］。明膠基凝膠允許水溶性添加劑，具有生物可降解性。但是，明膠基凝膠在空氣中因快速干燥而導致硬化，影響其作為創面修復材料的穩定性和耐久性。研究證明，在明膠中加入食品級添加劑，如糖、甘油、檸檬酸等，不會損害材料的生物相容性和安全性，可產生具有彈性和韌性的凝膠組合物［4－5］。

我們以明膠為基底，加入可食用甘油，用以增強明膠的熱穩定性及保水性，并利用檸檬酸使其交聯，制備了新型甘油／明膠基水凝膠（GG 水凝膠），研究其生物相容性和修復皮膚缺損的效果，為進一步臨床應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

高糖DMEM（Hyclone，美國）；胎牛血清（FBS）、1%的青鏈霉素和胰蛋白酶－EDTA（Thermo Fisher Scientific，美國）；明膠、檸檬酸和甘油（Merck，德國）；CCK－8 試劑（Dojindo，日本）；活死細胞染色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。

多功能酶標儀（Tecan Spark，瑞士），共聚焦顯微鏡（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 制備GG 水凝膠

將甘油（8 g）溶解在去離子水中（8 g）并加熱至60 ℃。冷卻至室溫后，加入明膠粉末（4 g），浸泡1 h?；旌衔镌?0 ℃的烘箱中真空下攪拌1 h（2 350 r／min，45 kPa），并加入1%檸檬酸以獲得均勻的成膠前液體。澆筑模具中，冷卻即可得到凝膠。

1.2.2 細胞培養

人皮膚成纖維細胞（HSFs）來源于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。標準細胞培養環境下（37 ℃、5%CO2以及飽和濕度），使用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM 培養，細胞達到80%融合后傳代。

1.2.3 GG 水凝膠的生物相容性

用CCK－8 法和活／死細胞染色分別測定細胞活力和增殖能力。將1×104個HSFs 包裹在200μL凝膠中。在培養1 d、3 d 和7 d 時，將原培養基換成含有CCK－8 試劑的新鮮培養基，并于37 ℃下培養1.5 h。使用多功能酶標儀測量490 nm 處的光密度（OD）值。以活死細胞染色試劑盒在培養7 d 時進行檢測，共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 GG 水凝膠修復皮膚缺損

18 只6 周齡SPF 級小鼠，雌雄不限，平均體質量20 g（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。動物實驗通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物倫理委員會批準。

小鼠麻醉后背部備皮，并在背部中間造成直徑10 mm 的全層皮膚缺損。將小鼠隨機分為3 組：對照組（n＝6）、GG 水凝膠治療組（n＝6）和GG 水凝膠＋細胞治療組（n＝6）。對照組為空白對照，不予任何處理；GG 水凝膠治療組：將凝膠前體液200μL涂抹于皮膚缺損創面；GG 水凝膠＋細胞治療組：將凝膠前體液200μL 與1×104個HSFs 混合后涂抹于皮膚缺損創面。術后小鼠全部單籠飼養，自由進食和飲水。術后即刻和術后11 d 對創面行大體觀察并拍照，使用Image J 軟件（1.51 版）進行創面面積定量分析。

術后11 d 創面取材，4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋切片，HE 染色［6－7］。

1.2.5 統計學分析

采用GraphPad Prism 8 進行統計學處理。組間比較采用單因素方差分析和Tukey 后分析法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GG 水凝膠的生物相容性

用CCK－8 法測定凝膠內部的HSFs 增殖情況。結果顯示，術后7 d 時的OD 值明顯高于術后1 d 和3 d 時（P＜0.001），說明GG 水凝膠內部的HSFs 能夠維持增殖?；钏兰毎旧珜嶒灡砻?，超過95%的HSFs 在水凝膠表面存活長達1 周。上述結果表明，HSFs 可以在GG 水凝膠內生長、增殖，維持其代謝活性，GG 水凝膠具有良好的生物相容性（圖1、2）。

圖2 活死染色法測定HSFs 在GG 水凝膠內部的存活情況（不同方向觀測到的熒光圖像）Fig.2 Viability of HSFs in GG hydrogel measured by living／dead staining（fluorescent images observed in different directions）

2.2 GG 水凝膠用于皮膚缺損修復

如圖3 所示，小鼠全層皮膚缺損創面涂抹GG水凝膠前體液后，大體觀察可見各組在整個實驗過程中均未發現明顯的感染及其他并發癥。與對照組和GG 水凝膠治療組相比，GG 水凝膠＋細胞治療組傷口愈合明顯更快。定量分析顯示，術后11 d 時，GG 水凝膠＋細胞治療組剩余的創面面積僅為最初面積的8.3%±1.0%，明顯小于對照組的49.5%±0.9%（P＜0.05）。

圖3 術后創面大體觀察及創面面積定量分析Fig.3 Gross observation and area quantitative analysis of the wound after operation

為了研究水凝膠的滲透作用和傷口完全閉合后的組織重塑情況，術后11 d 時對創面組織取材并行HE 染色觀察。結果顯示，對照組小鼠組織中含有少量的新生肉芽組織、新生毛細血管及膠原蛋白沉積，同時伴有大量的炎性細胞；GG 水凝膠治療組中水凝膠發生了降解，創面新生肉芽組織明顯形成；GG 水凝膠＋細胞治療組中表皮細胞分層明顯，排列整齊，表皮和真皮連接緊密，可見毛細血管増生，血管周圍無明顯炎性細胞浸潤，并且可觀察到皮脂腺等皮膚附屬器，且成纖維細胞排列有序，與周圍組織相互交叉。上述證據表明，GG 水凝膠輸送HSFs 并作為原位形成的皮膚替代物可用于治療皮膚缺損創面（圖4）。

圖4 HE 染色法測定各組小鼠全層皮膚缺損修復情況（10×）Fig.4 Repair of full－thickness skin defects in each group determined by HE staining（10×）

3 討論

研究表明，細胞因子在創面愈合中具有重要作用［8］，而且有效的細胞輸送方法不僅可提高移植細胞的存活率，而且對保持其多能特性和功能狀態至關重要。將細胞混入水凝膠中可以方便地輸送細胞，且水凝膠可適應任意大小、形狀的創面或空腔［9］。本研究中，天然明膠和甘油分子為水凝膠提供了細胞黏附基質。結果表明，HSFs可以很好地黏附和擴散在GG 水凝膠中，保持活力，持續增殖。體內試驗我們利用小鼠全層皮膚缺損模型，檢測GG 水凝膠包裹HSFs 用于治療皮膚缺損的可能性。結果顯示，含有HSFs 的水凝膠顯著改善了創面的再上皮化，并促進了創面閉合。在創面愈合的早期階段，GG 水凝膠有效地抑制了創面中炎性細胞的浸潤。本研究中，水凝膠在體內大約11 d 后有明顯分解，表明其降解速率是適當的，可引導宿主成纖維細胞浸潤到損傷區域，促進顆粒組織形成，可防止過度收縮和纖維化。明膠是一種基質金屬蛋白酶敏感的生物降解分子，來源于膠原蛋白。研究表明，明膠水凝膠的降解速度是可調的，通過優化水凝膠的降解速率，相信GG 水凝膠包裹細胞的治療方法能更好地滿足臨床治療的需要。

綜上所述，本研究構建的甘油／明膠基水凝膠具有優異的穩定性及生物學性能，有望用于臨床皮膚缺損修復。