脂肪干細胞來源外泌體在皮膚創面修復中的作用機制

姜文彬 陳靂風 孫家明

【提要】 皮膚創面修復有多種方法，但均存在一定的局限性。近年來，有關脂肪干細胞來源外泌體的研究日益增多，大量研究表明脂肪干細胞來源外泌體在皮膚創面修復過程中具有積極的作用。本文對脂肪干細胞來源外泌體在皮膚創面修復中的作用機制研究進行綜述，并展望其在皮膚組織再生領域的應用前景。

皮膚創面愈合，尤其是皮膚慢性傷口愈合是所有皮膚疾病中醫療費用最高的一類，僅在美國，每年就有281 億美元以上的醫療支出用于治療慢性創面［1］。盡管皮膚組織具有一定的自我修復能力［2］，但創面愈合不良，尤其是暴露部位的創面愈合不良，仍可導致皮膚屏障功能減弱、組織感染和壞死等嚴重后果。臨床上迫切需要更新、更有效的方法來促進愈合過程，以達到形態和功能上的最佳效果。外泌體是指由干細胞分泌的具有單層膜結構的微小囊泡，直徑30～200 nm。根據目前的研究，外泌體具有與細胞相同的拓撲結構，其中包含了復雜的RNA、脂質和蛋白質。研究發現，外泌體除了可以在免疫學、腫瘤生物學和神經生物學中作為生物標志物［3］、生物載體［4］和治療工具［5］外，在組織再生方面也具有潛在的臨床應用價值。脂肪干細胞具有來源廣泛、取材方便等優點，該來源的外泌體在多種組織的修復和再生方面具有治療潛力［6］，其中也促進皮膚組織創面的愈合［7］。

1 脂肪干細胞外泌體

脂肪干細胞（Adipose－ derived stem cells，ADSCs）在人體內儲量豐富，應用脂肪抽吸術可以很容易地從皮下脂肪組織中獲得ADSCs［8］。ADSCs具有強大的增殖分化能力、多向分化能力，且獲取便利、創傷小、副作用少，常用于組織再生與修復，是組織工程領域的研究熱點。越來越多的研究發現，ADSCs 發揮作用主要依賴于旁分泌機制，通過向胞外分泌大量物質來實現，如可溶性細胞因子、生長因子、功能蛋白、脂質、microRNAs、lncRNAs 等［9－11］。

外泌體（Exosomes，Exos）是包含了復雜RNA 和蛋白質的微小囊泡，直徑為30～200 nm，主要來源于細胞內溶酶體，它是由溶酶體微粒向內凹陷形成多泡體，而后多泡體與細胞膜融合，將其內的微小囊泡分泌到胞外而形成。研究發現，Exos 可廣泛參與細胞間的信息交流及多種生理、病理過程，如機體免疫應答、抗原呈遞、細胞分化等。Exos 的免疫原性低于細胞，可有效降低由細胞移植導致的免疫排斥；而且，Exos 與干細胞不同，在使用上不存在倫理學問題，這使其可代替干細胞進入臨床應用。根據目前的研究，ADSCs－Exos 在皮膚創面愈合［12］、骨與軟骨再生［13］、受損神經修復及心肌損傷修復［14］、腎臟損傷修復［15］、肝臟損傷修復［16］等領域有廣闊的應用前景。

1.1 ADSCs－Exos 的分離純化

方便快捷的分離純化法，是標準和高效地進行ADSCs－Exos 研究的保障。目前，分離純化ADSCs－Exos 最常用的方法是差速離心法，利用外泌體與其他物質間直徑大小以及密度的差異，通過一系列不同離心力、不同離心時長的超速離心［17］逐步將其他物質沉淀后去除，最終分離出外泌體。超速離心通常由多個步驟組成，首先低離心力（300 ×g，10 min）去除死亡細胞和凋亡碎片，然后提高離心力［（1 000～20 000）×g，20～30 min］去除較大的囊泡和碎片，最后以高離心力（100 000 ×g，70 min）獲得ADSCs－Exos［18］。此方法操作簡便，得到的外泌體量多，但是提取時間長，且提取的外泌體純度不足［19］。

免疫磁珠法也是常用的ADSCs－Exos 分離方法。外泌體膜上存在著多種特異性蛋白，利用抗體與外泌體膜上的特異性蛋白產生免疫反應，經沉淀可分離外泌體。免疫磁珠吸附分離耗時短，外泌體純度高，但分離前需進行充分的預處理，以去除其他的細胞外囊泡，否則將影響外泌體的純度。

近年來，一些新方法被用于ADSCs－Exos 的分離和純化，如微流控技術、尺寸排阻色譜技術、靜水壓濾透析技術以及超濾技術等。每種方法都有其優缺點，目前還沒有統一的規范，應根據實驗科學背景及后續實驗內容選擇合適的分離純化方法［20］。

1.2 ADSCs－Exos 的鑒定與儲存

脂肪干細胞來源外泌體鑒定的常用方法有形態學分析、特異性蛋白表達。電子顯微鏡下觀察ADSCs－Exos，可見膜的茶托樣結構，直徑30～200 nm；利用Western blot 或抗體芯片對ADSCs－Exos 表面特定蛋白進行檢測，其表面蛋白陽性表達的有FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101 等。

外泌體通常儲存于－80 ℃環境下。但最近的報道表明，與新鮮提取的外泌體相比，在－80 ℃條件下長期保存的外泌體并不穩定，有可能導致其內部RNA 的降解。Charoenviriyakul 等［21］開發了一種凍干儲存外泌體的方法，在室溫下儲存凍干外泌體，既不會影響外泌體RNA 含量、理化和藥代動力學特性，也不會影響外泌體上蛋白質和DNA 的功能。

2 皮膚組織的結構與皮膚創面愈合的過程

2.1 皮膚組織的結構

皮膚是在人體表面直接同外部環境接觸的組織，具有保護、分泌、調節體溫等重要作用。皮膚分3 層，最外層的表皮主要由復層扁平上皮組成，由淺到深又可細分為角質層、透明層、顆粒層、棘細胞層、基底層等5 層；中間的真皮層主要由膠原纖維、彈力纖維構成，內含豐富的血管、神經末梢、毛囊和各種腺體，由淺到深可細分為乳頭層和網狀層；最深處的皮下組織，位于真皮以下肌肉筋膜以上，是維持皮膚彈性的重要結構，主要成分為脂肪組織［22］。

2.2 皮膚創面愈合的過程

皮膚創傷是由于疾病或外部暴力而導致的表皮、黏膜或組織破損。皮膚具有自我修復能力，皮膚創面的愈合由一系列復雜而動態的組織恢復階段組成，常需要免疫細胞、造血細胞和皮膚常駐細胞的共同參與［23］。深達真皮的皮膚創面修復包括4 個相互重疊的階段，分別為止血、炎癥、增殖和重塑，每個階段又有精密調節的多個子階段。各個階段間相互依賴，密不可分。

第一階段是止血階段，這是機體對創傷的迅速反應。在這個階段，血小板和纖維蛋白原的聚集會導致血凝塊的形成，暫時封閉傷口［24］，有的凝塊表面干燥形成痂皮，凝塊及痂皮可起到保護傷口的作用。第二階段是炎癥階段，皮膚創面形成后數小時內便出現炎癥反應，表現為局部充血、漿液性滲出及白細胞游出，故導致創面局部紅腫。早期白細胞浸潤以嗜中性粒細胞為主，約3 d 后轉為以巨噬細胞為主。血小板釋放的細胞因子將中性粒細胞和巨噬細胞聚集到創傷部位，和常駐的肥大細胞一起，開始殺滅入侵的微生物，并清除創傷部位的細胞碎片［25］。第三階段是增殖階段，由白細胞釋放的激素誘導內皮細胞和成纖維細胞向傷口中心遷移，形成新的血管和肉芽組織。肉芽組織由傷口底部及傷口邊緣長出，以填平缺損組織，其中沒有神經，故無感覺。毛細血管以0.1～0.6 mm／d 的速度增長，生長方向大都垂直于創面，并呈袢狀彎曲。從傷后第5～6 天起，成纖維細胞產生膠原纖維，其后的1 周內膠原纖維形成更為活躍，以后生成速度逐漸減緩。隨著膠原纖維的增多，瘢痕形成，可能是由于局部張力的作用，瘢痕中的膠原纖維最終與皮膚表面平行。同時，創面周圍的成纖維細胞也可以進一步刺激傷口邊緣角質形成細胞的遷移和增殖，使新表皮完全覆蓋傷口。第四階段是重塑階段，為了恢復正常皮膚的結構，瘢痕重塑，新沉積的膠原分子交聯，導致組織的拉伸強度增加［26］，在此過程中膠原纖維不斷合成、交聯和降解，這一階段可長達數月至數年［27］。

3 ADSCs－Exos 促皮膚創面修復的機制

皮膚創面愈合是機體動態、精密的生理反應過程。內源性ADSCs 已被證明參與了皮膚創面的愈合過程，其分泌的Exos 也被證實在減輕炎癥反應、加速血管生成、促進成纖維細胞的增殖與遷移和細胞外基質的重塑中發揮著不可替代的作用。

3.1 ADSCs－Exos 可通過多種機制減輕炎癥反應

炎癥反應是創面修復的始動環節之一，但過度的炎癥反應會延緩皮膚創面的愈合過程，并可能使創面發展為經久不愈的慢性創面，故減輕傷口愈合的炎性反應是皮膚創面修復中的重要一環。炎癥反應階段是以血管系統為中心的一系列局部反應，由巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞等共同參與，炎性反應階段可清除壞死組織及入侵細菌，促進愈合過程。研究發現，減少創面的炎癥反應，可以減少瘢痕的生成。例如，早期胎兒和口腔傷口的無瘢痕愈合過程，是缺乏典型的炎癥反應的創面愈合［28］，這類過程與傷口炎癥反應下游的轉化生長因子β1（TGF－β1）有關［29］。外泌體減輕炎癥反應的機制多種多樣，如介導siRNA 傳遞來阻斷神經系統炎癥小體激活［30］；通過抑制促炎酶和細胞因子的分泌而發揮抗炎作用［31］；通過LIN28b／LET－7 軸抑制核因子κB（NFκB）的激活，從而抑制牛子宮內膜上皮（BEND）細胞的炎癥［32］；通過3 個特異性miRNAs（miR－21、miR－146a 和miR－181），抑制小鼠內毒素誘導的炎癥［33］。其中，ADSCs－Exos 對減輕炎癥反應的作用更為突出［34］。首先，ADSCs－Exos 可誘導巨噬細胞向M2 表型極化，從而降低了巨噬細胞激發炎癥反應的能力［35］；而白細胞介素－10（IL－10）作為一種有效的抗炎物質，能夠抑制由炎癥反應造成的創面延遲愈合。另外，高表達Nrf2 的ADSCs－Exos 可降低IL－1β、IL－6 和TNF－α 等炎癥細胞因子水平，從而降低創面的炎癥反應［36］。

3.2 ADSCs－Exos 可加速血管生成

局部血液循壞是影響創面愈合的重要因素，可以提供組織再生所需營養物質和氧氣，促使細胞生長、肉芽組織形成；另外，對吸收壞死組織及控制局部感染也起到了重要作用［37］。當局部血流循環良好時，創面再生修復快；相反，局部血液供應不良時，該處的創面愈合遲緩。新生血管的形成是加速局部血液循環的關鍵，在創面愈合的過程中意義重大［38］。研究發現，ADSCs－Exos 可以刺激內皮細胞增殖、遷移和血管形成，進而增加局部組織的血液循環，加速創面愈合過程。這種加速血管生成的效應多是通過各類特異性miRNAs 的高表達來實現的。實驗證實，通過miR－130a 的高表達，可顯著促進小鼠體內的血管生成［39］；通過miR－21 的高表達，可明顯促進人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的血管化［40］。另有研究發現，ADSCs－Exos 可以通過轉運功能性酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs），來增加內皮細胞的遷移和血管的形成，加速血管生成的過程［41］。

3.3 ADSCs－Exos 可促進成纖維細胞的增殖與遷移

促進成纖維細胞的增殖、遷移是皮膚創面愈合以及傷口收縮的關鍵。纖維蛋白凝塊的分解、細胞外基質（ECM）的重塑和膠原纖維的形成過程，都有成纖維細胞的參與［42］。ADSCs－Exos 可以通過多種機制促進成纖維細胞的增殖與遷移。多項研究表明，外泌體miRNA 對成纖維細胞有積極作用。如，人羊膜上皮細胞來源的外泌體miRNA 可促進成纖維細胞增殖和遷移，促進傷口愈合［43］；外泌體miRNA 的上調會促進癌癥相關成纖維細胞（CAF）的形成和激活［44］。另外，Exos 內包含的各類蛋白也對成纖維細胞有著重要影響。Bakhtya 等［45］證明了Exos 在體外可以提高成纖維細胞活力，并在小鼠的穿孔活組織創傷模型中促進皮膚傷口的愈合，這些效應與Exos 內含有大量的α2 巨球蛋白有關。而ADSCs－Exos 作用于成纖維細胞增殖與遷移的研究，近些年開展廣泛。研究認為，ADSCs－Exos 在角膜基質成纖維細胞的形成中可發揮關鍵作用，ADSCs－Exos 可以增強角膜基質成纖維細胞的活力，促進角膜基質細胞向成纖維細胞轉化［46］。另外，ADSCs－Exos 可以通過優化成纖維細胞的特性來促進皮膚傷口的愈合。ADSCs－Exos 刺激成纖維細胞后，以劑量依賴的方式刺激細胞遷移、增殖和膠原合成［47］，Ⅰ型膠原（COL1）、Ⅲ型膠原（COL3）、MMP1、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和TGF－β1 mRNA 水平均升高，在體內可顯著促進創面愈合［48］，在體外可提高p－Akt／Akt 水平，這是促進傷口愈合的重要信號通路［49］。Ren 等［50］的研究也證明了這一觀點，認為ADSCs－Exos 加速了成纖維細胞中AKT 和ERK 信號通路的激活，在體外和體內均可促進成纖維細胞的增殖、遷移。

3.4 ADSCs－Exos 可促進細胞外基質的重塑

ECM 是細胞周圍由多種大分子組成的復雜網絡，與傷口愈合的重塑階段密切相關，在瘢痕的形成過程中也發揮重要作用。但是，目前針對ADSCs－Exos 作用于皮膚創面處細胞外基質重塑的文獻十分有限，大量研究僅停留在ADSCs－Exos 對細胞外基質的重塑的促進作用［51］，對于ADSCs－Exos 促進細胞外基質重塑的具體機制，仍有待進一步研究。

4 結論與展望

相較于細胞治療，ADSCs－Exos 治療具有來源豐富、易儲存、性質穩定、免疫原性低、不受倫理限制等諸多優勢，為今后的臨床治療方案提供了新的思路。因此，近些年相關研究廣泛開展，針對ADSCs－Exos的制備與純化、組成成分，及其促進組織修復機制的高質量研究越來越多，這為ADSCs－Exos 的臨床應用提供了更加堅實的理論基礎。此外，眾多研究也提出了諸多不同的ADSCs－ Exos 應用方法，如直接注射ADSCs－ Exos 懸液、同敷料聯合使用、結合載藥技術等。近年來，3D 打印技術飛速發展，結合水凝膠光固化打印的ADSCs－Exos 水凝膠表面敷料將是未來的研究與應用的熱點之一。

盡管有著諸多明顯的優勢，ADSCs－ Exos 的臨床應用仍存在諸多問題。目前，外泌體的提取和純化過程比較繁瑣，且缺乏特定細胞來源外泌體的統一鑒定方法，應用于人體的安全劑量也尚未知曉，對其不良作用、副作用及長期效果還缺少深入研究［52］。

綜上所述，ADSCs－Exos 為創面修復提供了一種新的可能，但要真正地應用于臨床，必須先明確其發揮作用的具體機制、可能存在的不良作用、長期效果的穩定性、給藥劑量及給藥途徑等，這一切都需要進行更為深入的基礎研究和臨床前期研究。