肝臟脫細胞基質微顆粒促進HepG2 細胞球狀體形成與肝相關功能分化的研究

胡佳辰 金巖 劉文佳

肝臟組織工程研究是肝臟再生醫學中的重要分支，旨在構建出肝功能替代治療中的生物人工肝支持系統（Bioartificial liver support system，BALSS），或用于藥物肝毒性篩查的生物肝組織［1］。然而，足量、易于獲取的肝功能性細胞的來源問題仍未得到有效解決。HepG2 等永生化肝細胞系具有一定的肝細胞功能，具有較好的應用潛力，但肝細胞功能水平較差，是限制其在BALSS 和毒性篩查應用中的主要障礙［2－3］。

細胞的培養方式是影響細胞功能狀態的關鍵［4－5］，通過改變HepG2 細胞的普通2D 培養方式，其肝相關功能也可得到提升。由于細胞的3D 培養形式使細胞更接近于體內的3D 生存模式，因而能提高體外培養細胞的功能基因表達，更有利于細胞的功能分化［6］。研究表明，3D 球狀體的培養形式相比于普通的2D 培養，能更好地促進永生化肝細胞系和人原代肝細胞（Primary human hepatocytes，PHH）的肝功能表達［6－7］。另外，細胞外的基質微環境也是影響細胞功能狀態的重要因素［8－9］。細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）是體內細胞外基質微環境的重要載體。ECM 中包含了膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白以及蛋白多糖等纖維骨架成分，這些成分為多種細胞生長因子的貯存和細胞的黏附提供了條件，從而促進細胞的存活和分化［10］。因此可以推測，以3D 形式構建球狀體的同時加入ECM，能夠更好地促進HepG2 細胞球狀體的形成和肝相關功能的分化。

肝臟脫細胞細胞外基質（Decellularized extracellular matrix，dECM）是通過脫細胞的方法獲取的組織特異性ECM［11］。通過對肝臟組織進行洗脫劑和酶等的灌流和洗脫，肝臟組織中的細胞成分被去掉，留下了組織特異性的ECM 成分和部分生長因子［10－11］。研究表明，在體外培養HepG2 或PHH時加入dECM 制備的凝膠，能夠更好地維持細胞的存活與功能狀態［12］；另外，dECM 支架再細胞化后能支持肝實質細胞的存活和功能，如白蛋白分泌、尿素合成和細胞色素P450 表達，其水平接近于正常肝臟［13］。由于dECM 具有種屬間低免疫原性的特點［14］，異種dECM 可以應用，并成為dECM 的重要來源。此外，dECM 具有多種應用形式，包括細胞支架與水凝膠等。微顆粒形式的dECM 能夠更好保留ECM 的天然特性，同時能夠應用于HepG2 細胞的3D 球狀體構建。本研究推測dECM 微顆粒能夠通過促進HepG2 球狀體形成和提供微環境，進而促進HepG2 細胞的肝功能分化。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

SD 大鼠，雄性，體質量250 g，SPF 級，空軍軍醫大學動物實驗中心提供。本研究符合動物實驗倫理原則。HepG2 細胞系（Procell CL－0103）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

肝素鈉（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司）；氫氧化鈉，Triton X－100（上海麥克林生化科技有限公司）；氯仿，異丙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；DMEM 高糖培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（Sigma－Aldrich，美國）；Trizol，LIVE／DEAD 細胞活性毒性檢測試劑盒（Invitrogen，美國）；DEPC 水，引物（上海生工生物工程有限公司）；5×PrimeScript RT Master Mix，RNase Free H2O，2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa，日本）；超低吸附培養板（Corning，美國），靜脈留置針18 G（江西洪達醫療器械集團有限公司）；人白蛋白酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；尿素檢測試劑盒Urea Assay Kit（Abcam，美國）。

蠕動泵（LongerPump，英國）；真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發展有限公司）；石蠟切片機（Leica，德國）；CO2恒溫細胞培養箱（Thermo Scientific，美國）；倒置相差顯微鏡，倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；離心機（Eppendorf，德國）；酶聯免疫檢測儀（Bio－Tek，美國）；基因擴增儀（Biometra GmbH，德國）；實時熒光定量PCR 儀（Bio－Rad，德國）。

1.2 肝臟脫細胞基質的制備

將肝素鈉生理鹽水浸潤靜脈留置針管腔，并排空氣泡，備用。SD 大鼠麻醉后備皮。沿腹正中線及肋下緣剪開腹壁，形成T 型切口，暴露肝臟與腸管。暴露肝門區及門靜脈，置入留置針，經留置針注入肝素鈉生理鹽水，同時剪斷下腔靜脈，沖洗肝臟。沖洗后，剪斷腔靜脈、肝動脈及膽管、肝周各韌帶，游離肝臟。將游離肝臟的留置針與蠕動泵管連接，以3.5 mL／min的速度依次灌流含肝素鈉的PBS 溶液1 h；雙蒸水，30 min 進行溶脹；含0.02%EDTA 的PBS 溶液，30 min；含1%Triton 與0.05%NaOH 的水溶液，進行脫細胞處理，持續12 h；雙蒸水，4 h；含慶大霉素的PBS，8 h。將制備好的脫細胞支架放入含有雙抗的PBS 溶液中，4 ℃保存。

1.3 脫細胞基質微顆粒的制備

將脫細胞基質放于液氮中冷凍2 min，隨后在液氮冷凍的條件下于研磨機中研磨成粉末。分裝于離心管中，于真空冷凍干燥機中凍干24 h。用PBS 重懸dECM 凍干粉末，2 000 r／min 離心5 min，沉淀，PBS 重懸為dECM 大顆粒。吸取上清，20 000×g離心15 min，棄上清，沉淀，PBS 重懸為dECM 小顆粒。再離心后，用0.3%過氧乙酸重懸沉淀，室溫放置10 min進行消毒。隨后離心，使dECM 沉淀，PBS 重懸清洗，重復清洗5 遍。

1.4 正常肝臟與dECM 的組織染色與形態學觀察

將肝臟與dECM 浸入4%多聚甲醛中固定，過夜。取出組織塊，流水沖洗，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，HE、Masson 與免疫組織化學染色。掃描電鏡樣品制備時，將新鮮肝臟（對照）與dECM 浸入戊二醛電鏡固定液中固定過夜，然后放入真空冷凍干燥機中凍干24 h。掰斷或撕開截面，噴金，放入掃描電鏡觀察。

1.5 HepG2 細胞的培養與接種

含10%FBS 的高糖DMEM 培養基培養HepG2細胞，每2～3 d 換液一次，細胞融合至80%時傳代。普通3D 培養時（對照組），將500μL 細胞懸液接種于24 孔平底超低吸附培養板或200μL 細胞懸液接種于96 孔U 型底超低吸附培養板。與dECM 混合進行3D 細胞培養時（dECM 組），用培養基重懸dECM 沉淀，加入24 孔平底超低吸附培養板或96孔U 型底超低吸附培養板中，再加入含相同細胞數量的細胞懸液。接種后的細胞培養板，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中孵育，每2 d 換液一次。24孔平底超低吸附培養板換液時，吸盡孔內培養基，加入500μL 新鮮完全培養基；96 孔U 型底超低吸附培養板換液時，只吸除孔內100μL 培養基，再加入100μL 新鮮完全培養基。

1.6 HepG2 細胞培養上清的人白蛋白和尿素氮檢測

回收24 孔平底超低吸附培養板第4、6、8 天換液時的培養上清，－80 ℃保存。檢測當日于冰上解凍，振動混勻并離心。按照人白蛋白酶聯免疫吸附測定試劑盒和尿素檢測試劑盒的方法步驟，進行檢測。

1.7 實時熒光定量PCR

3D 培養12 d 時，提取dECM 組及對照組96 孔U 型底超低吸附培養板中HepG2 細胞球狀體的總RNA。2D 培養時，細胞融合至90%時，提取總RNA。從培養箱中取出細胞培養板置于冰上，吸除培養液，加入PBS 清洗2 遍。吸盡PBS，每孔加入250μL Trizol，于冰上裂解5 min。將培養板孔中的Trizol 吹吸均勻后，移入無酶EP 管中。獲得RNA沉淀后，用75%乙醇洗滌。用20μL DEPC 處理水溶解RNA 沉淀，測量RNA 濃度。配制10μL 的反轉錄體系，加入RNA 500 ng，5×RT Mix 和相應體積無酶水，進行反轉錄并獲得cDNA。配制10μL 定量PCR 體系，依次加入TB Green Premix Ex Taq Ⅱ5μL，上下游引物各0.4μL，無酶水3.2μL，cDNA 1μL。上下游引物序列詳見表1。上機進行擴增循環，獲得相應數據后，以GAPDH 管家基因作為內參，根據ΔΔCt 值作圖。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.8 統計學分析

使用GraphPad Prism 8 進行統計學分析。數據以表示，組間比較采用Student’st檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫細胞基質的制備與表征

正常肝臟溶脹后，經過12 h 脫細胞灌流，可見肝臟逐漸變成無色至白色之間的半透明樣果凍狀物質（圖1A）。在脫細胞的過程中可見，有色的肝實質細胞成分被逐漸洗去，而半透明的ECM 成分被保留下來。在HE 與Masson 組織學染色中可見，dECM 呈纖維網絡狀結構；與正常肝臟相比，已無細胞狀與肝小葉樣的形態結構，但可見管腔樣的形態結構；dECM 的Masson 染色為藍色纖維樣形態，提示為膠原纖維；DAPI 熒光染色可見dECM 中無細胞核狀結構；SEM 顯示dECM 為無細胞纖維狀結構（圖1B）。免疫組織化學染色顯示，dECM 保留了膠原、型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白幾種ECM 的主要成分（圖1C）。

圖1 脫細胞細胞外基質的制備與表征Fig.1 Preparation and characterization of decellularized extracellular matrix

2.2 dECM 顆粒的制備與粒徑分布

經過液氮冷凍研磨，dECM 呈細顆粒狀冰晶粉末，真空冷凍干燥后再用PBS 重懸，為白色懸濁液（圖2A）。懸液在2 000 r／min 的速度下離心獲得較大的dECM 顆粒，其粒徑分布測量顯示，體積加權平均直徑為98 μm；去掉大顆粒dECM，在較高速度離心下可獲得較小直徑的dECM 顆粒，其粒徑主要分布在數百納米到數微米之間（圖2B）。

圖2 脫細胞基質微顆粒的制備和粒徑分布Fig.2 Preparation and particle size distribution of decellularized matrix microparticles

2.3 dECM 顆粒促進HepG2 細胞形成球狀體

在U 型或平底超低吸附培養板中培養HepG2細胞，接種時加入dECM 顆粒，細胞更容易形成致密的細胞團塊，即球狀體（圖3A、圖3B）。Live／Dead染色顯示，細胞團中的細胞存活，其中無dECM 對照組中有個別紅染亮點（死細胞），表明dECM 顆粒能夠更好地促進細胞存活（圖3C）。

圖3 脫細胞基質顆粒促進HepG2 球狀體形成Fig.3 Decelluarized matrix particles promoted the formation of HepG2 spheroids

2.4 dECM 顆粒促進HepG2 球狀體肝相關功能分化

連續收集細胞培養上清，dECM 組的細胞培養上清中可檢測到更高濃度的白蛋白和尿素氮；對照組與dECM 組的培養上清中，白蛋白與尿素氮濃度均隨著培養天數的增加而增加，而dECM 組增加的趨勢更為明顯（圖4A、圖4B）。PCR 結果顯示，以3D 形式培養的HepG2 球狀體，相對于2D 培養，有更高的肝功能相關基因表達；而加入dECM 的3D球狀體培養組，肝功能相關基因表達水平更高，其中包括CYP 類Ⅰ類代謝酶、UGT 類Ⅱ類代謝酶、OAT2Ⅲ類代謝酶；另外，3D 培養組中Ki67 基因表達水平均低于2D 組，說明細胞處于低增殖狀態（圖5）。

圖4 HepG2 球狀體分泌功能評估Fig.4 Evaluation of secretory function of HepG2 spheroid

圖5 HepG2 細胞球狀體肝功能相關基因的表達Fig.5 Expression of liver function related genes in HepG2 Spheroids

3 討論

HepG2 細胞系是被廣泛應用于肝臟組織工程與肝功能相關研究領域的類肝細胞系，來源于一個15 歲的白人男性的肝癌組織，是人的肝癌細胞系，但具有一些肝臟實質細胞特有的功能。這些功能包括多種血漿蛋白的分泌，如白蛋白、轉鐵蛋白、維甲酸結合蛋白、β－脂蛋白、補體等，以及一定的物質代謝和解毒的能力［15］。由于上述特性和易于獲取、可大量擴增、處理簡單且壽命無限等特征，HepG2 細胞系成為生物人工肝支持系統（Bioartificial liver support system，BALSS）的常用細胞源，以及藥物毒性篩查常用的肝實質細胞替代細胞系。雖然人原代肝細胞（Primary human hepatocytes，PHH）最接近體內肝實質細胞的狀態，是藥物與毒素的肝毒性檢測最具有體外參考價值的“金標準”［16］，但難于獲取，性狀在體外培養中難以維持且存在個體差異，因此無法廣泛應用［17］。另外，由于PHH 不能擴增和大量獲取，也限制了其成為BALSS 的細胞來源。因此，永生化的類肝細胞系成為在這些領域中替代PHH 的重要細胞來源。HepG2 細胞系是這類細胞系中的重要一員，相關的研究與應用較多。

HepG2 細胞系與PHH 相比，肝功能和代謝相關的基因表達和蛋白質水平都較低，成為限制其應用的最主要因素。其原因是，在傳統的2D 培養中，HepG2 細胞呈二維平面狀態生長，缺乏極性，表達低水平的細胞色素代謝酶、外源物質轉運體和核受體，以及較低的蛋白分泌水平。而3D 形式的HepG2 細胞球狀體形式培養，能顯著提高HepG2 細胞的肝功能狀態和水平［6］。同時，3D 球狀體低增殖、高功能狀態的特性，為高通量的藥物肝損傷預測和提供BALSS 的細胞來源提供了便捷。另一原因是，體外細胞培養缺乏體內維持細胞功能狀態的微環境和因子，而ECM 是這些因子和微環境的載體。天然ECM 中結合有多種酶、生長因子和其他生物活性分子，從而影響細胞功能［18］。Lee 等［12，19］的研究表明，用ECM 凝膠為HepG2 細胞提供生長環境時，能明顯提高其功能狀態，分泌更多的白蛋白和尿素氮，并促進細胞的體外存活。同時，ECM 中也存在很多細胞黏附位點，能通過增加細胞黏附，從而促進球狀體的形成。因此，在ECM 環境中培養的HepG2球狀體相比于二維培養的HepG2 細胞，理論上具有更好的肝細胞功能。

然而，利用單一的ECM 成分或個別成分的混合使用，很難完全模仿天然ECM 的特性。通過脫細胞方法獲得的dECM 能較完整保留組織特異性的ECM 成分，因此具有天然ECM 的屬性和功能，能夠為細胞提供定植、存活和誘導功能分化等信號［20］。通過灌流脫細胞直接獲得的肝臟dECM 具有完整的器官形態結構，但是并不便于直接應用。為便于使用和制作細胞生物支架，以往研究中常將dECM 用酶消化，以形成凝膠。但這些消化的過程會破壞dECM 中的成分，而影響dECM 的生物活性。利用液氮冷凍研磨法將dECM 制備成微顆粒，能夠避免酶解消化過程，最大限度保留ECM 中的活性成分。同時，微顆粒形式的dECM 也便于后續的消毒處理、保存運輸和化學修飾等；并且dECM 微顆粒也能直接應用于細胞的三維培養，能夠促進3D 球狀體的形成和提高細胞的功能狀態。

本實驗利用灌流脫細胞法獲得的dECM 保留了天然ECM 中的多種成分，并且可研磨成不同直徑的微顆粒。用不同離心速度分離微顆粒，可以獲得直徑在數百納米到數微米不等的dECM 微顆粒。實驗結果表明，將這些粒度較小的dECM 微顆粒應用于HepG2 細胞的3D 培養，可以促進HepG2 細胞形成更致密的球狀體；加入dECM 微顆粒的HepG2 球狀體組，細胞分泌白蛋白和尿素氮的水平增加；PCR結果也表明，加入dECM 微顆粒后，細胞的肝功能相關基因的表達水平也提升。因此，dECM 微顆粒能夠通過促進HepG2 細胞球狀體的形成和提供細胞外基質微環境，進一步提高HepG2 細胞的肝相關功能狀態。

綜上所述，dECM 以微顆粒的形式結合細胞的3D 培養，是提高HepG2 細胞肝相關功能狀態的一種有效方法。該方法可以使HepG2 細胞在藥物肝毒性篩查和生物人工肝裝置等肝臟組織工程領域的應用中具有更好的功能狀態，發揮更大的應用潛力。同時，也為其他永生化肝細胞系在肝臟組織工程領域中的應用提供了借鑒。