TGF-β/Smad通路成員Smad2和Smad7及MMP-9蛋白在早發性子癇前期胎盤中的表達及意義

聶付芳，楊培峰，杜淑文，任方

(鄭州大學第三附屬醫院/河南省婦幼保健院婦產科，河南 鄭州 450052)

0 引言

子癇前期是一種妊娠特異性疾病，其特點是妊娠20周后出現新發高血壓和/或伴隨的臨床和實驗室指標的變化，是嚴重危害母胎健康的主要原因，其全球發病率為3%～8%；胎盤娩出后臨床癥狀自行消失。而發生于34周之前的子癇前期被稱為早發型子癇前期(EOPE)，其病情進展迅速，且常合并多種并發癥，嚴重時甚至直接導致胎兒死亡，對母嬰的身體健康造成了嚴重的威脅[1]。滋養細胞浸潤及侵襲不足、螺旋小動脈的不完全重塑、血管阻力增大，胎盤灌注減少，缺血缺氧，被認為在此疾病病因中起著重要作用[2,3]。

目前子癇前期的發病機制依然不明，在胎盤發育的整個過程中，細胞因子通過參與滋養細胞的信號對話，實現對胎盤發育的調控作用，其中TGF-β/Smad通路參與了機體廣泛的生理活動，例如滋養細胞的分化、細胞凋亡、免疫調節和胎盤植入[4]。近年來，有大量研究認為TGF-β/Smad通路成員的傳導紊亂在子癇前期的發生發展中起重要作用。現對該通路的主要成員受體激活型Smad2、抑制型Smad7及其下游因子MMP-9在子癇前期的發生發展所扮演的角色進行探討。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取自2019年1月至2020年10月于我院分娩的EOPE孕婦的胎盤組織30例作為實驗組，另取同期正常分娩的孕婦胎盤組織30例作為對照組.納入標準：(1)均為單胎妊娠，胎兒無畸形；(2)所有納入對象均符合EOPE相關診斷標準[5]；(3)孕期均在本院進行完整的產前檢查，且資料完整。排除標準：(1)孕期檢查發現存在妊娠期糖尿病、腎臟疾病、血液系統疾病以及甲狀腺功能異常；(2)孕期接受過心腦血管藥物治療或心血管疾病；(3)子宮先天性發育異常或胎盤異常；(4)無法正常交流溝通或伴有精神疾病。兩組年齡、孕次、體重指數(BMI)、產次等一般資料比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。本研究已獲本院倫理委員會審查批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

表1 對照組和SPE組孕婦一般臨床資料

1.2 方法

1.2.1 標本的采集與制備

胎盤娩出后，立即取胎盤母體面中央區域，剪除底蛻膜層，避開鈣化壞死區，取叢密絨毛膜層組織2塊，大小約為1.0cm×1.0cm×0.5cm，4℃生理鹽水沖洗，10%中性甲醛固定24h，石蠟包埋，4μm厚切片備用。

1.2.2 主要試劑

上海生工兔抗人Smad2、Smad7及MMP-9多克隆抗體。

1.2.3 免疫組化

將標本連續切片，脫蠟，水化，抗原熱修復，滅活內源性過氧化物酶，封閉液室溫孵育30min，滴入一抗，恒溫4℃冰箱過夜，滴加二抗，再次孵育30min，上述間隔均需用PBS沖洗，DAB顯色約10min，蘇木素復染，脫水，透明，最后封片。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行臨床資料統計學分析。Image J軟件進行圖像分析，graphpad 7進行圖像數據分析。檢驗計量資料數據的正態性及方差齊性，若數據滿足正態分布，則以(±s)表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析(ANOVA)，并用Bonferroni法進行事后檢驗；P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

MMP-9蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質中呈棕黃色染色。1A：正常組，胎盤合體滋養細胞可見大量棕黃色顆粒，部分血管內皮細胞的細胞質中可見黃色顆粒。1B：早發型子癇前期組，胎盤合體滋養細胞胞質可見淺黃色染色，部分細胞核可見淺黃色染色。1C：Image J軟件對MMP-9的免疫組化結果圖進行半定量分析，*P＜0.05，表示統計學有意義。

Smad7蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質和部分細胞核中，呈棕黃色染色。2A：正常組，胎盤合體滋養細胞、血管內皮細胞的胞質及部分細胞核中可見大量棕黃色顆粒。2B：早發型子癇前期組，胎盤合體滋養細胞、血管內皮細胞的細胞質及部分細胞核中可見淺黃色顆粒。2C：Image J軟件對Smad7的免疫組化結果圖進行半定量分析，*P＜0.05，差異有統計學意義。

Smad2蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質及部分細胞核中呈棕黃色染色。3A：正常組，胎盤合體滋養細胞及血管內皮細胞胞質中可見淺黃色染色。3B：早發型子癇前期組，胎盤合體滋養細胞及血管內皮細胞的胞質及部分細胞核中可見大量棕黃色顆粒。3C：Image J軟件對Smad2的免疫組化結果圖進行半定量分析，*P＜0.05，表示統計學有意義。

2.1 兩組孕婦的胎盤組織中MMP-9蛋白表達結果

免疫組化結果顯示：MMP-9蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質，呈棕黃色染色見圖1(1A-1B)。且早發型子癇前期組的染色程度弱于正常組，見圖1(1C)；差異具有統計學意義，*P＜0.05。

圖1 免疫組化結果顯示

2.2 兩組孕婦的胎盤組織中Smad7蛋白表達結果

免疫組化結果顯示：Smad7蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質以及部分細胞核，呈棕黃色染色見圖2(2A-2B)。早發型子癇前期組的染色程度明顯低于正常組，見圖2(2C)；差異具有統計學意義，*P＜0.05。

圖2 免疫組化結果顯示

2.3 組孕婦的胎盤組織中Smad2蛋白表達結果

免疫組化結果顯示：Smad2蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質以及部分細胞核，呈棕黃色染色見圖3(3A-3B)。且早發型子癇前期組的染色程度高于正常組，見圖3(3C)；差異具有統計學意義，*P＜0.05。

圖3 免疫組化結果顯示

3 討論

子癇前期多在妊娠20周以后出現，即胎盤功能成熟后開始發病，在胎盤娩出后病情得到迅速緩解，提示胎盤可能在子癇前期發病中起著關鍵作用[6]。Kadyrov[7]等人研究發現早發型子癇前期患者胎盤著床部位的子宮全層標本中，滋養細胞侵入不足，胎盤組織細胞凋亡明顯增加，螺旋小動脈重塑不足，管腔狹窄，胎盤著床較淺，故得出早發型重度子癇前期更傾向于是一種胎盤疾病。近年來的研究表明晚發型子癇前期胎盤的滋養細胞不存在過度凋亡現象，推測晚發性子癇前期的發病原因可能與胎盤關系不大，而與母體因素有關[8]。故而得出早發型子癇前期和晚發性子癇前期可能存在不同的發病機制。

就目前而言子癇前期的發病機制主要有子宮螺旋小動脈重鑄不足、胎盤淺著床、炎癥反應過度激活、血管內皮細胞受損、滋養細胞過度凋亡等幾種學說。研究表明TGF-β/Smad通路不僅在惡性腫瘤的發生發展中起著重要作用，而且也在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中擔當了重要角色，EMT可能是促進滋養細胞轉移所必須經歷的一個過程。Smad蛋白與轉化生長因子-β(TGF-β)超家族配體相結合傳遞信號，其通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶受體來調節細胞的增殖、分化和凋亡。Smad的蛋白在各種生物體及人類各組織中均有表達。Smad蛋白按其功能分為3類：一類是受體調節型R-Smad，可直接與受體結合，包括Smad1、2、3、5、8；一類是共同結合型Co-Smad，只有Smad4一種；最后一類是抑制型I-Smad，包括Smad6、7[9]。抑制型受體通過干擾R-Smad的磷酸化或競爭性抑制R-Smad和Co-Smad之間復合物的形成來抑制兩組的信號功能[10]。然而Smad6會優先抑制BMP[11]；而Smad7抑制活化素、TGF-β及BMP信號通路[12]。

抑制型Smad7已被證明是TGF-b信號通路的細胞內拮抗劑[13]。于洪等人的研究表明，在心臟重塑過程中，Smad7可抑制MMP-9的活性[14]，而Seiya Kato等人的研究表明Smad7過表達能夠促進細胞增殖[15]；Sangmin Kim等人的研究表明在乳腺癌細胞中，表皮生長因子(the epidermal growth factor；EGF)誘導的MMP-9的表達被Smad7的過表達完全抑制，進而推斷Smad7可能抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移作用[16]，這說明了Smad7對機體得調控受表達量影響。

絨毛外滋養細胞得侵襲和遷移常伴有細胞外基質得降解和重塑。MMPs是細胞外基質的降解和重塑的關鍵酶，MMP-9是一類結構中含有鋅和鈣的蛋白水解酶，在體內主要參與細胞外基質(ECM)的降解，MMP-9可降解大部分變性的膠原及IV、V型膠原。滋養細胞侵入母體的過程包括滋養細胞的黏附、基質的溶解和細胞的遷移。其中，基質的溶解是侵蝕過程的重要環節，滋養細胞本身并不能吞噬溶解基質，但可分泌作用于細胞外基質的酶。其中MMP-9是降解蛻膜基質的重要酶類[17]；其主要功能是降解和重塑細胞外基質的動態平衡，研究報道MMP-9是調節絨毛外滋養細胞遷移和侵襲所必須的[18]。

本研究的免疫組化結果顯示，Smad7蛋白于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞膜、細胞質及細胞核中均有表達；且早發型子癇前期組胎盤組織中的表達量明顯低于正常妊娠胎盤組。MMP-9蛋白主要表達于胎盤滋養細胞、血管內皮細胞的細胞膜、細胞質及細胞核中也均有表達，且早發型子癇前期組胎盤組織中的表達量明顯低于正常妊娠胎盤組織。Smad2蛋白主要表達于胎盤合體滋養細胞和血管內皮細胞的細胞質以及部分細胞核，且早發型子癇前期胎盤組織中的表達量高于正常妊娠胎盤組織。說明Smad7和MMP-9于早發型子癇前期的發病中的作用可能存在正相關性，而Smad2與MMP-9的表達于早發型子癇前期的發病中可能存在負相關性。根據前人對TGF-β/Smad的研究推測Smad7的低表達可能降低了其對TGFβ1-Smad2/smad3表達的抑制，導致此信號通路的過表達，從而抑制了MMP-9的表達，近而抑制絨毛外滋養細胞的遷移和侵襲，參與子癇前期的發病[19]。

雖然Smad7的作用是有爭議的，但我們的結果表明，較正常胎盤組織，早發型子癇前期胎盤組織中Smad7和MMP-9表達均下降，而Smad2在早發型子癇前期組呈高表達狀態，提示Smad7和MMP-9在子癇前期發病中可能存在正相關性，而Smad2和MMP-9在子癇前期發病中可能存在負相關性。