腫瘤壞死因子α誘導蛋白3基因多態性與食管癌臨床特征相關性研究

黎秀月 蘇珍 何艷 鄒國榮 曹小龍

[摘要]目的探討腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（TNFAIP3）基因多態性在食管癌癌組織與癌旁組織的分布差異及與臨床病理參數的相關性。方法利用聚合酶鏈式反應（PCR）和一代測序技術，對2016年1月至2019年7月在廣州市番禺區中心醫院住院的30例食管癌手術患者癌組織與對應癌旁組織中 TNFAIP3基因7個多態性位點（rs2230926、rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）進行檢測。結果分析 TNFAIP3基因的7個多態性位點的不同基因型頻率在食管癌患者癌與癌旁組織中的分布，差異無統計學意義（ P >0.05）;各多態性位點不同基因型與患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期均無相關性。結論 TNFAIP3基因7個多態性位點（rs2230926、rs5029928、rs5029939、 rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）的基因型頻率在食管癌患者癌與癌旁組織分布無差異，不同基因型與食管癌患者臨床參數也無相關性。

[關鍵詞]腫瘤壞死因子α誘導蛋白3基因;基因多態性;食管癌;一代測序

[中圖分類號] R735.1? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）24-0192-05

Correlation between tumor necrosis factor-alpha-induced protein3 gene polymorphism and clinical features of esophageal cancer LI? Xiuyue??? SU? Zhen??? HE? Yan??? ZOU? Guorong??? CAO? Xiaolong

Department of Oncology， Guangzhou Panyu Central Hospital， Guangdong， Guangzhou 511400， China

[Abstract] Objective To investigate the distribution difference of tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3（TNFAIP3） gene polymorphism between esophageal cancer （EC） tissues and adjacent tissues and its correlation with clinicopathological parameters. Methods Polymerase chain reaction （PCR） and first-generation sequencing technology were used to detect seven polymorphic sites （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） of TNFAIP3 gene in cancer tissues and corresponding adjacent tissues of 30 patients with EC who were hospitalized in Guangzhou Panyu Central Hospital from January 2016 to July 2019. Results The distribution of different genotype frequencies of 7 polymorphic sites of TNFAIP3 gene in cancer and adjacent tissues of EC patients was analyzed， and there was no significant difference （P >0.05）. Different genotypes of each polymorphic site were not correlated with age， gender， tumor location， tissue differentiation， invasion depth， lymph node metastasis and clinical stage. Conclusion There is no difference in the genotype frequency of seven polymorphic loci （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） in the distribution of cancer and adjacent tissues of EC patients， and there is no correlation between different genotypes and clinical parameters of EC patients.[Key words] Tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3 gene; Gene polymorphism; Esophageal cancer; First generation sequencing

腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）是 NF-κB 誘導表達的泛素編輯酶，位于人類染色體6q23，具有去泛素化酶和泛素連接酶的雙重生物學功能，通過修飾 NF-κB 信號通路中的一些重要信號蛋白的泛素化狀態而發揮調控 NF-κB 表達狀態的功能[1-2]。 TNFAIP3基因在人群中呈現不同的多態性位點，已有研究表明 TNFAIP3基因多態性與包括類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、原發性干燥綜合征在內的自身免疫性疾病的疾病易感性和臨床病理參數有一定的相關性[3-5]。此外，該基因的多態性位點 rs610604可以作為食管癌預后的獨立預測因子[6]。但針對 TNFAIP3基因多態性和食管癌臨床特征的關聯性研究未見報道。本研究旨在利用一代測序技術對 TNFAIP3基因進行多態性位點分型檢測，探討各多態性位點的不同基因型頻率在食管癌癌組織與癌旁組織中的分布差異及與患者臨床病理參數的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2016年1月至2019年7月于廣州市番禺區中心醫院住院的30例食管癌手術患者的組織蠟塊。納入標準：①患者在本院接受食管癌根治手術，且術后病理結果明確診斷為食管癌;②患者所有臨床資料完整;③患者同意配合研究工作。排除標準：①術前已行化療或放射治療患者;②合并其他類型惡性腫瘤患者;③轉移性食管癌患者。所有患者均依照2010年國際抗癌聯盟（VICC）及美國癌癥聯合會（AJCC）提出的第7版食管癌分期標準進行分期，并選取相應癌旁組織作為對照組[7]。

1.2儀器試劑

Ezup柱式動物組織基因組 DNA 抽提試劑盒（B518251），Taq Plus DNA 聚合酶（B600090），10× PCR Buffer（含 Mg2+）（B600017），dNTP（B500056），瓊脂糖（A500016），50× TAE（B548101），DNA Ladder Mix（100～ 3000 bp）（B500347），SanPrep柱式 PCR 產物純化試劑盒（上海生工生物有限公司， B518141）。使用的儀器包括： PCR 儀（美國 ABI 公司），3730XL 測序儀（ABI 公司），凝膠成像儀（上海復旦科技有限公司），DYY-6C 電泳儀（北京六一）等。

1.3方法

① DNA 提取：收集30例食管癌患者癌組織和對應癌旁組織，嚴格按照試劑盒說明書進行 DNA 提取。② DNA 質量檢測：利用瓊脂糖電泳檢測提取的 DNA 完整性，分光光度計檢測濃度和純度。③ PCR 擴增：依據引物設計原則設計合適的引物進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為：模板 DNA 1?l，上下游引物各1?l，dNTP mix 1?l，Taq Buffer（with? MgCl2）2.5?l，Taq 酶0.2?l，加 ddH20至25?l;反應程序為預變性95℃5 min，接著進入循環步驟變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃60 s，共38個循環，72℃終延伸10 min。④1%瓊脂糖電泳檢測擴增結果。利用 PCR 產物純化試劑盒進行膠回收。⑤測序：測序引物由上海生工生物公司合成并進行最后的測序工作，見表1。

1.4統計學方法

采用 SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用[n （%）]表示，比較采用 Fisher's 精確檢驗;各多態性位點不同基因型和臨床參數的相關性分析，由于樣本量較小，采用 Fisher's 精確檢驗， P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1基因分型結果

TNFAIP3基因7個多態性位點經一代測序發現：rs2230926共檢測到兩個基因型，為 G/T、T/T 型; rs5029928共檢測到兩個基因型，為 C/C、C/T 型; rs5029939共檢測到兩個基因型，為 C/C、C/G 型; rs610604共檢測到三個基因型，為 G/G、G/T、T/T 型; rs7753873共檢測到兩個基因型，為 A/A、A/C 型;rs9494885 共檢測到兩個基因型，為 C/T、T/T 型;rs583522共檢測到兩個基因型，為 C/T、T/T 型。見圖1。

2.2 TNFAIP3多態性位點基因型頻率分布

7個多態性位點的不同基因型頻率在食管癌癌組織與癌旁組織間分布比較，差異無統計學意義（ P >0.05）。見表2。

2.3 TNFAIP3基因多態性與食管癌臨床病理特征的相關性分析

本研究中，將食管癌常見的臨床病理參數（患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期）分別與不同的多態性位點進行相關性分析，未發現多態性位點的基因型分布與臨床病理參數間存在顯著的相關性，見表3～9。考慮可能由于本研究納入的樣本量太少所致。

3討論

食管癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，位于全球癌癥相關性死亡原因的第6位[8]。我國食管癌發病率占全球發病率一半以上[9]。目前對食管癌的研究主要集中在環境危險因素、飲食狀況、精神因素及是否喜好煙酒等方面。隨著分子生物學與細胞生物學等技術的快速發展，各國學者對食管癌的研究方向從環境因素逐步深入到分子水平的遺傳因素。基因多態性是指生物群體中同時存在兩種或以上不連續的基因型或等位基因[10]。大量研究表明，基因多態性研究對幫助闡明疾病易感性，預測疾病預后等方面都具有十分重要的意義[11-13]。迄今已有大量研究表明基因多態性與食管癌之間存在一定的相關性[14-15]。

既往研究表明 TNFAIP3基因在食管鱗癌患者中高表達，且可作為食管鱗癌的獨立預后危險因子[16]。另有文獻報道食管癌中 TNFAIP3基因 rs583522位點的不同基因型與疾病復發率存在一定的相關性，AA/AG 基因型比 GG 基因型的患者更易復發[17]。本研究通過一代測序技術對符合納入標準的30例食管癌患者癌組織與癌旁組織中 TNFAIP3基因的7個多態性位點（rs2230926、 rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、 rs9494885、rs583522）進行檢測，并對各基因型頻率在癌組織和對應癌旁組織中的分布差異進行統計分析，研究結果顯示各多態性位點的基因型頻率在癌與癌旁組織中分布差異無統計學意義。分析各多態性位點與常見臨床病理參數（患者年齡、性別、腫瘤部位、組織分化、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期）的相關性，尚未發現與這些參數有明顯相關性的多態性位點。綜上所述，結合已有相關研究，本研究尚未發現 TNFAIP3基因的7個多態性位點不同基因型頻率在鼻咽癌組織和癌旁組織間有明顯的統計學差異。各多態性位點與臨床常見病理參數之間也尚未發現明顯相關性。這與前期相關文獻報道并不吻合，考慮可能由于樣本量太少的原因，后期將通過擴大樣本量進一步收集數據分析。

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（收稿日期：2020-11-30）