三維熒光二階校正法用于水樣中培氟沙星和氧氟沙星的同時測定

謝麗霞 李志能

湯建新1, 2 譚益民1, 2

鄭思鄉(xiāng)3 廖曉珊3

1. 湖南工業(yè)大學(xué)

生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院

湖南 株洲 412007

2. 百合種質(zhì)資源創(chuàng)新與深加工

湖南省工程研究中心

湖南 株洲 412007

3. 株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所

湖南 株洲 412007

1 研究背景

氟喹諾酮類（fluoroquinolones）抗生素如諾氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星等，是一類人工合成的廣譜抗菌藥，通過抑制細菌的DNA解旋酶Ⅱ和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ來影響細菌的DNA復(fù)制[1-2]。氟喹諾酮類抗生素廣泛用于治療家禽家畜疾?。ㄓ杉毦?、支原體感染引起的消化、呼吸等系統(tǒng)疾?。3]，但是，濫用抗生素現(xiàn)象較嚴(yán)重。抗生素的不合理使用不僅危害動物健康，而且未被家禽家畜吸收的抗生素會隨排泄物進入環(huán)境水體，給人類的健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅[4-7]。因此，迫切需要建立一種簡單有效且可以實現(xiàn)環(huán)境水樣中多種氟喹諾酮類藥物同時檢測的方法，以滿足環(huán)境水體中痕量抗生素的監(jiān)測需求。

目前，氟喹諾酮類藥物的檢測方法以液相色譜與各種檢測器聯(lián)用為主，如紫外檢測器[8-9]、熒光檢測器[10-11]、質(zhì)譜檢測器[12-14]。用液相色譜與檢測器聯(lián)用法時，需要對樣品進行繁雜的預(yù)處理（如液液萃取、膜分離等），對液相色譜分離條件進行優(yōu)化，這會消耗大量的有機溶劑，且繁雜的預(yù)處理勢必會損失目標(biāo)分析物，使其定量分析不準(zhǔn)確。此外，毛細管電泳法[15]、酶聯(lián)免疫法[16]檢測氟喹諾酮類抗生素的研究也有報道，但是毛細管電泳法靈敏度（sensitivity，SEN）低、檢測限（limit of detection，LOD）高，酶聯(lián)免疫法存在有機物間的交叉反應(yīng)，因而兩者在氟喹諾酮類抗生素定量分析中的應(yīng)用受到一定限制。

直接用熒光檢測技術(shù)定量分析復(fù)雜環(huán)境體系中氟喹諾酮類抗生素時，氟喹諾酮類抗生素之間的光譜重疊[17]以及自然水體中存在的內(nèi)源熒光物質(zhì)會對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾，因而需要其他手段或方法進行輔助?；瘜W(xué)計量學(xué)二階校正方法具有二階優(yōu)勢，以數(shù)學(xué)分離有效地代替復(fù)雜的物理分離，可以在有未知干擾存在的情況下獲取目標(biāo)物的定性定量信息[18-21]。因此，本研究擬以培氟沙星和氧氟沙星為目標(biāo)物，采用三維熒光結(jié)合二階校正法進行同時定量測定。

2 方法原理

2.1 三線性成分模型

經(jīng)三維熒光測量，單個樣本可以得到一個大小為I×J的激發(fā)發(fā)射熒光矩陣，I、J分別為激發(fā)、發(fā)射波長通道數(shù)。將K個樣本測量得到的熒光矩陣在第三維上進行組合，可以得到一個三維熒光響應(yīng)數(shù)據(jù)陣（I×J×K）。由于物質(zhì)的熒光強度與濃度符合朗伯-比爾定律，因此，理想情況下滿足三線性成分模型，模型中元素xijk為

式中：N為測量體系中所有具有響應(yīng)信號的組分?jǐn)?shù)，包含感興趣目標(biāo)分析物、未知干擾成分及噪聲等；

ain、bjn、ckn分別為具有物理意義的相對激發(fā)光譜矩陣A（I×N）、相對發(fā)射光譜矩陣B（J×N）和相對濃度矩陣C（K×N）中的元素；

eijk為三維熒光殘差數(shù)據(jù)陣中的元素。

式（2）～（4）中：Xi..、X.j.和X..k分別為三維熒光數(shù)據(jù)陣在I、J和K方向的切片矩陣；

Ei..、E.j.和E..k分別為三維熒光殘差數(shù)據(jù)陣在I、J和K方向的切片矩陣；

ai、bj和ck分別為相對譜矩陣A、B和C的行矢量；

diag(.)為構(gòu)造對角矩陣函數(shù)。

若矩陣A、B和C的秩r滿足條件rA+rB+ rC≥2N+2，那么三線性成分模型的分解將是唯一的。

2.2 交替三線性分解算法

交替三線性分解算法[22]（alternating trilinear decomposition，ATLD）由吳海龍?zhí)岢?，用于解析三維數(shù)據(jù)陣，對三線性成分模型的3個切片矩陣進行迭代最小二乘求解，結(jié)果如下：

通過使用ATLD算法對獲得的三維熒光數(shù)據(jù)陣進行三線性成分分解，可以獲得與物質(zhì)信息相關(guān)的譜圖矩陣，即相對激發(fā)矩陣、相對發(fā)射矩陣和相對濃度矩陣。再將校正集中感興趣組分對應(yīng)的相對濃度與真實濃度進行一元線性回歸，得到單變量校正曲線，可以進一步預(yù)測感興趣組分在預(yù)測樣中的濃度。

2.3 品質(zhì)因子

品質(zhì)因子是用于評估三維熒光校正方法性能的參數(shù)。而預(yù)測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）[23]可用于評價預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度，其計算式為

式中：P為樣本總數(shù)目；

yp和分別為某個組分的真實濃度和預(yù)測濃度。

靈敏度[24]可用于評價方法的敏感程度，其計算式為

式中：kn為單位濃度待分析物的純信號，即單變量校正曲線中的斜率；

Aex和Bex分別為所有已校正組分在激發(fā)通道和發(fā)射通道上的相對光譜矩陣；

Aun和Bun分別為所有未校正組分在激發(fā)通道和發(fā)射通道上的相對光譜矩陣；

*表示Hadamard積；

nn為（n，n）處元素，表示第n個待分析物。

采用檢測限和定量限[25]評價方法的檢測和定量能力，其計算式如下：

式中s(0)為采用該方法進行定量分析時，空白樣本中感興趣目標(biāo)物預(yù)測濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤差，其計算式為

其中，h0為所用方法空白樣的杠桿；

和分別為校正濃度方差、儀器信號方差；

SEN為該方法的靈敏度。

3 實驗部分

3.1 試劑與儀器

試劑：培氟沙星（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）、氧氟沙星（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）、氫氧化鈉、醋酸鈉和醋酸，均購買自Aladdin；環(huán)境水樣來源于長沙湘江岳麓區(qū)段。所有溶液均用超純水配制。

儀器：熒光光譜儀，F(xiàn)-7000型，日立；超純水Milli-Q A10系統(tǒng)，默克集團；pH酸度計，PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司。

3.2 樣品配制與檢測

精確稱取一定量的培氟沙星和氧氟沙星，分別經(jīng)濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解后，用醋酸鈉/醋酸緩沖液（pH值為4）在10 mL棕色容量瓶中定容，使其質(zhì)量濃度分別為2, 4 μg/mL；再置于4 ℃下避光穩(wěn)定儲存30 d。使用時，先用醋酸鈉/醋酸緩沖液（pH值為4）稀釋一定倍數(shù)，再用于樣品制備。

校正集由7個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本構(gòu)成。校正集中感興趣的目標(biāo)物培氟沙星和氧氟沙星的濃度水平依據(jù)U7（72）均勻?qū)嶒炘O(shè)計[26]確定。校正樣本配制步驟如下：根據(jù)均勻?qū)嶒炘O(shè)計的濃度，分別準(zhǔn)確移取一定體積的培氟沙星和氧氟沙星稀釋液于10 mL棕色容量瓶中，用醋酸鈉/醋酸緩沖液（pH值為4）定容至10 mL，搖勻備用。

預(yù)測集由5個加標(biāo)的湘江水樣本（以下簡稱加標(biāo)樣本）和3個未加標(biāo)的湘江水樣本（以下簡稱未加標(biāo)樣本）構(gòu)成。加標(biāo)樣本配制步驟如下：分別準(zhǔn)確移取一定體積的培氟沙星和氧氟沙星稀釋液于10 mL棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確移取1 mL湘江水于該棕色容量瓶中，最后用醋酸鈉/醋酸緩沖液（pH值為4）定容至10 mL，搖勻備用。除了未加待分析物，3個未加標(biāo)樣本與加標(biāo)樣本的制備方法一樣。同時，配制了3個方法空白樣本以及1個培氟沙星參考樣本（ref01）和1個氧氟沙星參考樣本（ref02）。所有樣本的詳細濃度設(shè)計見表1。

表1 培氟沙星和氧氟沙星的濃度設(shè)計Table 1 The concentration designs of pefloxacin and ofloxacin in samples

所有樣本的熒光測量使用F-7000熒光光譜儀，以氙燈作為光源，室溫下在10 mm熒光比色皿中進行。測量熒光的激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍分別為230～400 nm, 360～580 nm（間隔均為2 nm）。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為5 nm，掃描速度固定為12 000 nm/min，檢測電壓為500 V。所用數(shù)據(jù)在Matlab軟件上進行處理，相關(guān)程序用Matlab語言編寫。

4 實驗結(jié)果與討論

4.1 待分析物和體系的光譜屬性

圖1為培氟沙星參考樣本、氧氟沙星參考樣本和湘江水樣的三維激發(fā)發(fā)射矩陣（excitation-emission matrix，EEM）熒光圖以及加標(biāo)樣本spik01的二維EEM投影圖。

圖1 培氟沙星、氧氟沙星和湘江水樣的三維EEM熒光圖和spik01的EEM二維投影圖Fig. 1 The EEM fluorescence spectra for pefloxacin, ofloxacin and the sample from Xiangjiang River, and the two-dimension contour for the spik01 sample

彩圖

由圖1可知，在所選擇的光譜區(qū)域內(nèi)，培氟沙星在278 nm處有最大激發(fā)峰，在449 nm處有最大發(fā)射峰，且在315 nm處存在一個較弱的激發(fā)熒光峰；而氧氟沙星在295 nm處有最大激發(fā)峰，在504 nm處有最大發(fā)射峰，且在330 nm處存在一個較弱的激發(fā)熒光峰；對于湘江水樣，體系中包含具有自發(fā)熒光的有機質(zhì)；培氟沙星、氧氟沙星和背景體系中的未知干擾物之間存在嚴(yán)重的熒光光譜重疊現(xiàn)象，待分析物的熒光光譜不具有完全選擇性。

在激發(fā)波長為230～400 nm、發(fā)射波長為360～580 nm范圍內(nèi)，存在嚴(yán)重的瑞利散射和拉曼散射。這兩類散射對應(yīng)的數(shù)據(jù)不具有三線性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致測量的三維EEM熒光數(shù)據(jù)偏離三線性成分模型，致使ATLD算法不能正確地解析出各個方向上的相對輪廓矩陣。為此，本研究采用插值法[27]處理受瑞利散射和拉曼散射影響的數(shù)據(jù)區(qū)域，將處理后的三維數(shù)據(jù)陣用于三線性成分模型。

4.2 組分?jǐn)?shù)選擇

將7個校正樣本、5個加標(biāo)樣本、3個未加標(biāo)樣本和3個方法的空白樣本激發(fā)發(fā)射熒光數(shù)據(jù)在樣品維上依次排列，可以得到一個激發(fā)-發(fā)射-樣本三維熒光數(shù)據(jù)陣，其大小為18×86×111。三線性分解之前，先采用核一致診斷（core consistency diagnostic）方法[28]對三維熒光數(shù)據(jù)陣中的組分?jǐn)?shù)進行估計，防止欠擬合或過擬合現(xiàn)象。在核一致診斷方法中，以核一致數(shù)值為考察對象，其定義為Tucker3核數(shù)陣與理論超對角單位數(shù)陣一致的方差百分比。當(dāng)核一致數(shù)值由一個較大數(shù)值驟然減小為一個較小數(shù)值時，表明合適的組分?jǐn)?shù)已被估計出。

圖2所示為激發(fā)-發(fā)射-樣本三維熒光數(shù)據(jù)陣的核一致診斷結(jié)果。

圖2 三維熒光數(shù)據(jù)陣的核一致診斷結(jié)果Fig. 2 The result of three-dimension fluorescence spectra matrix of core-consistency diagnosis

由圖2可知，此體系中，當(dāng)選取組分?jǐn)?shù)為1, 2, 3時，核一致數(shù)值都對應(yīng)于100%；組分?jǐn)?shù)大于3時，核一致數(shù)值開始減小；當(dāng)組分?jǐn)?shù)為5時，核一致數(shù)值減小為0。考慮到ATLD算法解析數(shù)據(jù)時對組分?jǐn)?shù)不敏感，多余的組分?jǐn)?shù)可以擬合數(shù)據(jù)中的噪聲，因此本研究采用組分?jǐn)?shù)為4進行數(shù)據(jù)處理，4個組分分別為培氟沙星、氧氟沙星、水樣中的未知干擾和噪聲。

4.3 三線性分解

本研究選取組分?jǐn)?shù)為4，采用ATLD算法對激發(fā)-發(fā)射-樣本三維數(shù)據(jù)陣進行解析。圖3為用ATLD算法分辨體系中具有熒光響應(yīng)信號物質(zhì)的相對激發(fā)光譜、相對發(fā)射光譜和相對濃度圖，以及兩個感興趣組分在各個光譜方向上的真實譜圖。

圖3 ATLD算法解析結(jié)果Fig. 3 The results obtained from the ATLD algorithm

由圖3可知，培氟沙星、氧氟沙星和湘江水樣中存在的熒光干擾物質(zhì)的光譜相互重疊；培氟沙星的相對激發(fā)光譜和相對發(fā)射光譜與實際測量的歸一化標(biāo)準(zhǔn)譜圖之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.997 4和0.995 9，氧氟沙星的相對激發(fā)光譜和相對發(fā)射光譜與實際測量的歸一化標(biāo)準(zhǔn)譜圖之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.996 9和0.994 7。上述結(jié)果表明，分解所得培氟沙星和氧氟沙星的熒光激發(fā)和發(fā)射譜圖與實際譜圖具有高度一致性，這說明采用ATLD算法解析本研究體系中的三維熒光數(shù)據(jù)陣，可以準(zhǔn)確地分辨出培氟沙星和氧氟沙星在各個方向上的譜圖信息。

4.4 定量結(jié)果

用上述解析得到的校正樣本中培氟沙星和氧氟沙星的相對濃度信息分別與其真實質(zhì)量濃度進行單變量線性回歸，建立相應(yīng)的線性回歸方程。之后，將預(yù)測樣本中培氟沙星和氧氟沙星的相對濃度分別代入方程中，即得預(yù)測樣本中目標(biāo)物的定量分析結(jié)果。圖4所示為待分析物培氟沙星和氧氟沙星的一元校正曲線。

圖4 基于ATLD算法的三維熒光二階校正法的線性回歸結(jié)果Fig. 4 The univariate regression in three-dimension fluorescence spectra coupled with second-order calibration method based on the ATLD algorithm

由圖4可得，兩種分析物的回歸方程分別為y= 40.06x+242.97和y= 34.27x–257.08，二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2和0.997 5。該結(jié)果說明，培氟沙星和氧氟沙星在其校正濃度范圍內(nèi)都具有良好的線性關(guān)系，進一步說明了基于ATLD算法的校正模型是準(zhǔn)確的。

表2中列出了基于ATLD算法的三維熒光二階校正法，對加標(biāo)樣本中培氟沙星和氧氟沙星的定量分析結(jié)果。為了進一步評價本文所提方法的性能和可行性，本研究計算了其靈敏度（SEN）、選擇性（SEL）、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）等品質(zhì)因子（見表2）。

表2 三維熒光二階校正方法對加標(biāo)預(yù)測集的定量分析結(jié)果和品質(zhì)因子Table 2 The quantitative results obtained from threedimension fluorescence spectra coupled with second-order calibration method in spiked samples and the figures of merit

由表2可知：

1）加標(biāo)樣本中培氟沙星和氧氟沙星的預(yù)測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）分別為8.29, 7.13 ng/mL，平均加標(biāo)回收率（均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）分別為（101.1±5.3）%,（99.7±4.7）%?？梢姸糠治鼋Y(jié)果符合要求，表明基于ATLD算法的三維熒光二階校正法可以實現(xiàn)環(huán)境水樣中培氟沙星和氧氟沙星的準(zhǔn)確定量分析。

2）對于待檢測分析物培氟沙星和氧氟沙星，本方法的靈敏度分別為8.05, 8.25 ng/mL，檢測限分別為2.14, 4.34 ng/mL，定量限分別為6.49, 13.16 ng/mL。雖然在純?nèi)芤褐校瑔挝粷舛认屡喾承菬晒鈴姸却笥谘醴承堑?，但是在?fù)雜體系中未知干擾物的熒光光譜與培氟沙星光譜重疊，導(dǎo)致用本方法檢測培氟沙星的靈敏度比氧氟沙星略低。

5 結(jié)論

本研究提出了基于ATLD算法的三維熒光二階校正法，用于環(huán)境水樣中兩種氟喹諾酮類抗生素培氟沙星和氧氟沙星的同時快速定量分析。實驗結(jié)果表明：本方法能在光譜重疊以及存在未知干擾物的情況下，準(zhǔn)確獲取待分析物的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和相對濃度信息，能對環(huán)境水樣中培氟沙星和氧氟沙星進行定量分析，實現(xiàn)環(huán)境質(zhì)量實時監(jiān)控。三維熒光二階校正法是一種準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟、高效和綠色的定量分析方法。