油茶籽濕渣發酵制備蛋白飼料的菌種選擇

蘇 玲

（河北綠茵生化科技有限公司，河北石家莊 050000）

油茶是一種山茶科植物，主要分布在長江下游以南地區（張暉等，2020；任澤文等，2019），對油茶育種及栽培技術研究歷史悠久。油茶是一種重要的油料作物，其主要成分包括不飽和脂肪酸、維生素、生育酚、油酸、亞油酸及黃酮等，具有重要的經濟價值和營養價值。目前，我國油料種植面積已達到436.7萬hm2，年產油茶量為67萬t，按照傳統工藝提油后茶籽餅約為80萬t（鄧桂蘭，2016）。油茶籽餅為茶油提純后的副產品，主要包含15%蛋白質，10%～15%皂素和30%～35%糖類物質等；油茶籽粕也是提純茶油的副產品，其含有25%蛋白質，20%多糖類物質。油茶籽餅粕具有較高的營養價值，同時其蛋白含量較高，可用作為植物蛋白飼料的重要來源（陳曉等，2015）。蛋白飼料是指飼料中蛋白質含量大于20%，粗纖維低于20%的一類飼料。蛋白飼料的粗蛋白質含量越高，其市場經濟價值越高。菌體蛋白飼料是以工業中廢水及農業加工下腳料等物質為原料，經過細菌和藻類等微生物發酵而獲得的菌體蛋白（黃浦等，2015）。菌體蛋白飼料的優勢是其蛋白含量高，營養豐富；菌體繁殖速度快，獲得菌體蛋白飼料周期短；菌體蛋白飼料的原料豐富，生產過程穩定（黃浦等，2015；衛洋洋等，2012）。

油茶籽濕渣是水酶解法提純茶油的副產品，經檢測其水分含量為73%，蛋白質為10%～14%，粗纖維為16%，皂素含量為1%～3%，油茶籽濕渣的水分含量較高，不及時處理極易發霉，影響其質量和環境，不利于直接作為蛋白原料。因而，適當處理油茶籽濕渣，降低其纖維素含量，提高菌體蛋白的含量，同時增加飼料適口性。本研究是以油茶籽濕渣為原料，選擇最佳的霉菌和酵母菌，將其接種到最佳的固體發酵培養基中進行發酵，便于降低其纖維素含量，提高飼料的蛋白質含量，改變其適口性，生產出優質的蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 材料葡萄酵母（Grape cerevisiae）、木糖酵 母（Xylose cerevisiae）、楊 梅 酵 母（Bayberry cerevisiae）、啤酒酵母（Beer cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青 霉（Penicillium glaucum（Pe 40）、毛 霉（Mucor mucedo（M06）、根 霉（Rhizopus oryzae）。該試驗微生物由企業單位實驗室提供。

1.1.1 油茶原料與培養基

油茶籽濕渣由企業單位提供。

斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基。

液體培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養基。

初選培養基：油茶籽濕渣與水分之比為1∶1，瓊脂粉含量為2%，pH為8～9，放入高溫滅菌鍋121℃進行滅菌，滅菌結束后冷卻到55℃倒入滅菌培養皿中，將其冷卻凝固。

固態發酵培養基：培養基中油茶籽濕渣與麩皮的含量分別為10%和70%，水含量為55%，pH為8～9，放入高溫滅菌鍋121℃滅菌，滅菌結束后冷卻到55℃，再倒入滅菌培養皿中，待其冷卻凝固。

1.1.2 主要設備 立體壓力蒸汽滅菌鍋、臺式空氣恒溫搖床、水平搖床、數顯鼓風干燥箱、恒溫搖床、震蕩培養箱、電子天平、酶標儀、恒溫水浴鍋、霉菌培養箱、立式超低溫保溫箱、電冰箱、分析試驗用純水機、電磁爐、超凈工作臺、光學顯微鏡、渦旋機、玻璃皿、若干燒杯、量筒、玻璃棒、棉花與紗布、石棉網。

1.1.3 主要試劑與材料 瓊脂粉，淀粉，葡萄糖，氫 氧 化 鈉（5%，2 mol/L），鹽 酸（5%，2 mol/L），硝 酸 鉀，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，PH試紙，對硝基苯酚，乙酸鈉，乙酸，甲醛，乙酰丙酮，硫酸銨。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基制備方法 固體培養基制備方法：首先，將200 g土豆切成碎末，對其加熱至沸騰，使用濾布過濾，將濾液放入燒杯中，向燒杯內加入1 L水、再放入23 g葡萄糖、19 g瓊脂粉；使用電磁爐對燒杯內液體培養基進行加熱，并用玻璃棒不斷攪拌，待其瓊脂全部溶解，放入立體壓力滅菌鍋加熱滅菌（121℃，30 min），將其液體培養基倒入玻璃皿中，放入超級潔凈工作臺中冷卻，以備用。

1.2.2 菌類培養方法 酵母菌擴大培養方法：先將酵母細菌接種到合適斜面培養基中，放入合適環境培養，使其處于活化狀態，再將其部分活化細菌培養后，將其接種到合適的液體培養基中進行擴大培養，放入恒溫搖床（200 r/min），28℃培養24 h后將液體酵母菌稀釋為不同濃度梯度，將其接種于不同標記斜面培養基中，放入細菌培養箱（28℃）中培養，24 h后對其細菌平板鏡檢計數，最終計算出細菌密度為2.5×107～3.1× 107cfu/mL。

霉菌擴大培養方法：先將霉菌接種到合適斜面培養基中，放入合適的環境中培養，使其處于活化狀態，再將部分活化細菌培養后，將其接種到合適的液體培養基中進行擴大培養，放入恒溫搖床（200 r/min）中28℃培養8 h，然后將液體霉菌稀釋為不同濃度梯度，將其接種于不同標記斜面培養基中，放入細菌培養箱（28℃）中培養24 h后，并對其細菌平板進行鏡檢計數，最終計算出細菌密度為3.5×107～4.2×107cfu/mL.

1.2.3 不同菌種初選試驗 將不同類型的酵母菌和霉菌進行接種活化，使用點值法接種在初選培養基中，每種菌種組合做4個重復。酵母菌類培養基中點4個點，霉菌培養皿中點2個點。放入恒溫培養箱中（28℃）培養，間隔14 h進行觀察霉菌與酵母菌培養情況。本研究是以菌種的生長狀況和生長密度為觀察指標，選取在油茶籽濕渣培養基中生長最好的菌種。

1.2.4 粗蛋白質的測定方法 油茶籽濕渣經酵母菌或霉菌發酵的粗蛋白質含量測定方法參考GB/T5009.5-2010記錄中分光光度法。

1.2.5 不同菌種復選試驗 對初次選取的菌種進行分類后，將其分別接種在相應標記的固體發酵培養基中，將其分別放入霉菌和酵母菌恒溫培養箱中（28℃）進行大量培養，培養6 d后對其培養基進行高溫（85℃）烘干，測定其粗蛋白質的含量，選取粗蛋白質含量最高的酵母菌和霉菌。

1.2.6 混合菌種選取試驗 對初選和復選的不同類型酵母菌和霉菌按照比例1∶1組合（2個菌種組合和3個菌種組合），將其不同組合酵母菌和霉菌按照12%菌體量接種到對應的固體發酵培養基中，分別放入霉菌和酵母菌恒溫培養箱中（28℃）大量培養2 d，進行混合菌種發酵試驗，對其培養基使用高溫（85℃）烘干，測定不同混合菌種組中粗蛋白質含量，選取不同混合菌種組中發酵產物粗蛋白質含量最高的作為最佳混合菌種組。

1.2.7 混合菌種接種比例和培養周期 將混合菌種選取試驗中的最佳霉菌和酵母菌組合按不同體積霉菌和酵母菌比例進行組合，霉菌：酵母菌=1：5（0.2）、2：5（0.4）、3：5（0.6）、4：5（0.8）、1：1（1），將不同組合酵母菌和霉菌按照12%菌體量接種到對應的固體發酵培養基中，放入不同類型恒溫培養箱中（28℃）培養，培養時間設置為2、4、6、8、10d，進行混合菌種發酵試驗，對其培養基使用高溫（85℃）烘干，測定其粗蛋白質含量，以便確定發酵的不同霉菌和酵母菌的比例和培養時間。

1.2.8 數據統計與分析 本試驗結果用“平均值±標準誤”表示。菌種初選試驗和復選試驗均采用“+”和“-”號表示。

2 試驗結果與分析

2.1 不同菌種初選試驗結果將8種不同類型的酵母菌和霉菌按照試驗培養方法進行培養，將其接種到初選培養基中，使用點培養方法，每組3個重復，統計不同類型菌種在油茶籽濕渣培養基的生長狀況，以便于分析得出最佳單個發酵菌種，其統計結果如表1所示。

表1 不同菌種初選結果

由表1可知，不同類型菌種在以油茶籽濕渣為底物的培養基上呈現不同的生長狀況，木糖酵母、啤酒酵母、根霉菌在此培養基中基本不生長，其余菌種均能在此培養基上生長，且生長情況較好。其主要原因是不同類型的菌種對營養物質的吸收和運用情況不同，也可能是油茶籽濕渣的其他營養物質對木糖酵母、啤酒酵母、根霉菌的生長存在抑制作用，才會導致3種菌類不能正常生長，而其他類型菌種能較好適應其培養基的營養物質和外部條件。

2.2 不同菌種復選試驗結果將初次選取的5種類型菌株：葡萄糖酵母、楊梅酵母、黑曲霉、青霉和毛霉，將其接種到固體發酵培養基中進行發酵培養，其粗蛋白質測定值如圖1所示。

圖1 不同菌種發酵實驗結果

由圖1可知，不同菌種經過發酵后其培養基中的粗蛋白質含量高低順序為：黑曲霉＞青霉＞楊梅酵母＞毛霉＞葡萄糖酵母＞對照組。這些結果說明經黑曲霉發酵后，該培養基發酵產物粗蛋白質含量最高。

2.3 混合菌種選取試驗結果將復選試驗中的優勢菌種按不同組合進行混合菌種發酵試驗，將其不同類型的酵母菌和霉菌組合劃分為組1：楊梅酵母菌+黑曲霉，組2：楊梅酵母菌+青霉，組3：楊梅酵母菌+毛霉，組4：楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉，組5：楊梅酵母菌+黑曲霉+毛霉，組6：楊梅酵母菌+青霉+毛霉，其粗蛋白質含量結果如下圖2所示。

由圖2可知，酵母和霉菌混合菌種組合發酵產物的粗蛋白質含量高于單菌種的發酵產物，本試驗結果與前人研究的酵母和霉菌混合能提高飼料中蛋白含量的結果類似。將3種不同類型菌種進行混合發酵試驗，該培養基產物中粗蛋白質的含量最高，而組5培養基發酵產物的粗蛋白質含量低于組4培養基發酵產物的粗蛋白質含量，組3培養基發酵產物的粗蛋白質含量最低。其中組4培養基發酵產物的粗蛋白質含量最高，因而將楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉組合確定為最佳的混合菌種。

圖2 不同混合菌種發酵實驗結果

2.4 混合菌種接種比例確定將混合菌種中最佳的組合按照不同體積比例接種到固體培養基中進行發酵培養，并測定其發酵產物的粗蛋白質含量，結果如圖3所示。由圖3可知，當混合菌種接種比例為3∶5時，該培養基中發酵產物的粗蛋白質含量最高，為35.67%；當混合菌種接種比例為4∶5時，其發酵產物的粗蛋白質含量下降；當混合菌種的比例為1∶1時，該發酵產物的粗蛋白質含量適當提高。當培養混合菌種時，酵母菌中利用原料中的營養物質合成一定量的蛋白質，霉菌可以分泌適量纖維素酶，該酶能將原料中的纖維素分解為單糖原類，為酵母的生長提供足夠的營養物質，因而，混合菌種的合適接種比例將會使得菌體蛋白含量增加。本試驗的混合菌種發酵接種比例為3∶5。

圖3 不同接種比例和蛋白含量關系

2.5 混合菌種培養周期確定將最佳混合菌種組合放入恒溫培養箱中，將其固體進行發酵培養，參考不同培養時間進行發酵，測定培養基中發酵產物的粗蛋白質含量，如圖4所示。

由圖4可知，最佳混合菌種組合培養基中粗蛋白質含量隨培養時間的增加而增加；培養到6～8 d時，該培養基粗蛋白質含量增幅較為緩慢。在8 d后，其培養基粗蛋白質含量開始下降。真菌生長發育培養周期為生長期、對數生長期、穩定期和衰亡期；培養基中粗蛋白質下降的主要原因是當真菌生長狀況達到穩定狀態并走向衰亡期時，該時期真菌的發酵能力逐漸降低，其蛋白質含量也會降低。隨著培養時間的延長，培養基內會長滿其他雜質，聞起來有較大霉味。因此，本試驗的混合菌種培育周期為8 d。

圖4 混合菌種培養周期與蛋白質含量的關系

2.6 油茶籽濕渣的發酵粗蛋白質含量對比分析由表2可知，經過楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉發酵油茶籽濕渣后，其產物的粗蛋白質含量明顯高于發酵前的粗蛋白質含量，為32.17%，產物有一種甜香味。該試驗結果與前人的研究結果類似，鄧佳蘭（2008）等以油茶籽濕渣為原料，對其進行酵母和霉菌發酵培養后獲得豐富的菌體蛋白。這些試驗結果說明油茶籽濕渣經過相應的霉菌和酵母菌發酵培養后，為菌體飼料提供了豐富的蛋白原料。

表2 油茶籽濕渣的發酵粗蛋白質含量對比

3 結論與分析

油茶籽濕渣是一種重要的菌體蛋白來源。本試驗對不同類型菌種進行發酵試驗比選，其結果表明，霉菌發酵效率高于酵母菌，其發酵結果較好；混合菌種的發酵效率高于其單一菌種，其發酵結果較好。培養基中楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉體積比為1∶2∶5，即為接種比例（3∶5），經過楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉發酵培養基油茶籽濕渣后，培養基中粗蛋白質含量為35.67%，顯著高于單一菌種發酵產物的粗蛋白質含量（23.45%）。

菌種最佳組合的選取是發酵試驗最關鍵的一步，良好的菌種決定了菌種蛋白的質量。本研究中酵母菌和霉菌的主要優勢為（1）能有效利用培養基中的碳源和氮源等；（2）繁殖周期短，生長速度快；（3）沒有毒害物質；（4）生產規程操作方便、穩定。在本研究中，對油茶籽濕渣使用酵母菌和霉菌進行混合發酵，其原因為霉菌能分解油茶籽濕渣的纖維素和淀粉類物質，將其轉化為碳源，為酵母生長活動提供足夠的營養物質，適量提高其菌體蛋白產量（劉曉梅，2004；Shojaosadat等，1999）。微生物在發生代謝活動時，相互之間還會進行協調作用，為培養基中發酵產物提供足夠的能量和物質。

當微生物發酵生產菌體飼料時，決定菌體蛋白質量的是菌種種類，影響微生物生長的外部因素為生長環境；影響微生物生長的條件為接種比例和培養周期。本研究對其混合菌種的最佳組合接種比例和接種培育周期進行對比分析，選定楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉的組合為最佳發酵搭配，確定其最佳接種比例為3∶5；培育周期為8 d。這些結果也說明最適宜的接種比例和培育周期是提高實驗發酵產物粗蛋白質含量的關鍵因素。

本研究以油茶籽濕渣為原料，添加15%麩皮和適量的水作為培養基，采用經試驗選取的最佳混合菌種組合進行發酵，以制備飼料蛋白，其發酵產物的粗蛋白質含量從19.78%提高到32.17%，同時提高其飼料適口性，為菌體蛋白飼料提供足夠的蛋白來源，有利于開發更優質的菌體蛋白飼料。