代謝組學分析甜菜堿對大腸桿菌合成蘇氨酸的影響

李杰,田俊宇,季圓清,元躍,徐慶陽,陳寧,范曉光

(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

L-蘇氨酸是人體必需氨基酸之一,具有恢復疲勞、促進生長發育的效果,被廣泛應用于食品、飼料和醫療等領域[1]。大腸桿菌是蘇氨酸的主要發酵菌株,通過對大腸桿菌系統改造能夠有效提升蘇氨酸產量[2]。例如,過表達蘇氨酸合成途徑的關鍵酶以優化碳代謝流；弱化競爭支路以積累可利用的前體物；降低胞內蘇氨酸消耗；提高胞外運輸等[3-6]。此外,通過優化碳氮源、溶氧等發酵條件,蘇氨酸的發酵產量進一步提升[7]。最近,研究者在蘇氨酸發酵過程中加入甜菜堿,提升了發酵菌株的耐高滲能力以及產酸能力[8]。

甜菜堿是在甜菜糖蜜中發現的季銨型生物堿,與蛋氨酸、膽堿的化學結構比較相似[9]。甜菜堿是高效的甲基供體,對脫氮假單胞菌維生素B12的生物合成具有促進作用[10-11]。甜菜堿還是一種重要的細胞相容性溶質,在滲透調節方面和保持酶活力方面具有重要作用。YING等[12]比較了4種不同的滲透壓保護劑海藻糖、甘氨酸、甜菜堿、脯氨酸對賴氨酸發酵的影響,發現甜菜堿比其他物質更能促進發酵菌株的生長以及產物積累。XU等[13]在研究乳酸發酵時發現,甜菜堿的加入能夠提升高糖濃度下乳酸菌的細胞生長速率和乳酸脫氫酶的活力,進而提高乳酸產量。隨著系統生物學的發展,從整體水平上研究細胞的生命活動現象已成為可能。通過定量分析細胞成分的變化情況,能夠全面地描述并預測細胞的代謝過程。因此,本研究以蘇氨酸生產菌株EscherichiacoliTHRD 為研究對象,采用代謝組學技術,考察產酸期甜菜堿作用下大腸桿菌胞內代謝物組成和含量的動態變化,篩選出與蘇氨酸合成代謝相關的差異代謝物,從代謝層面揭示甜菜堿對大腸桿菌的作用效果。

1 材料與方法

1.1 蘇氨酸發酵菌株及培養條件

蘇氨酸生產菌株E.coliTHRD保存于天津科技大學菌種保藏中心[14]。

種子培養基：蔗糖2.5%(質量分數)、酵母粉1%(質量分數)、蛋白胨0.6%(質量分數)、KH2PO40.12%(質量分數)、MgSO40.05%(質量分數)、FeSO410 mg/L、MnSO410 mg/L、維生素B11.3 mg/L、維生素H 0.3 mg/L、消泡劑1～2滴。調節pH至7.0～7.2。滅菌條件：115 ℃,15 min。

發酵培養基：葡萄糖3%(質量分數)、酵母粉0.2%(質量分數)、蛋白胨0.4%(質量分數)、檸檬酸鈉0.1%(質量分數)、KH2PO40.2%(質量分數)、MgSO40.07%(質量分數)、FeSO4100 mg/L、MnSO4100 mg/L、維生素B10.8 mg/L、維生素H 0.2 mg/L、消泡劑3～5滴。調節pH至7.0～7.2。滅菌條件：115 ℃,15 min。

發酵培養方法：將3 mL培養好的種子液接種到裝有30 mL發酵培養基的錐形瓶(500 mL)中,在37 ℃、220 r/min下培養菌體24 h。以添加0.5 g/L甜菜堿的發酵培養基為實驗組,無添加甜菜堿的為對照組。在發酵過程中,實驗組補加含2 g/L甜菜堿的60%的葡萄糖溶液,對照組補加60%的葡萄糖溶液。

1.2 發酵菌體收集及胞內代謝物提取

在取樣時間點用移液器快速量取1 mL發酵液,13 000 r/min、-4 ℃下離心3 min,用PBS洗滌2次后離心收集菌體。將菌體置于液氮中研磨成粉末,用天平稱取50 mg粉末置于1.5 mL離心管中,加入1 mL預冷的乙腈提取液,振蕩均勻后置于液氮中1 min,取出等待融化,如此反復凍融3次,使胞內代謝物逐漸被提取液溶出。13 000 r/min、-4 ℃下離心10 min,取上清液100 μL轉移至內襯管中,待測。

1.3 胞內代謝物檢測條件

使用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC Q-TOF MS)分析胞內代謝物。ACQUITY BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。UPLC采用正負2種離子模式進行采集。正離子模式的流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。負離子模式的流動相A為0.1%氨水溶液,流動相B為乙腈溶液。進樣量5 μL,進樣流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,梯度洗脫程序參照文獻[15]。Q-TOF采用ESI+和ESI-掃描模式,離子源溫度100 ℃,質核比掃描范圍50～10 000m/z,數據采集模式為Centroid。

1.4 數據處理

將所采集的數據使用Masslynx和Progenesis QI軟件(Waters,Milford,USA)進行色譜峰的導入、峰對齊、峰提取以及歸一化處理。采用無監督主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監督正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)進行多元統計分析。為了驗證多元統計分析篩選出的變量是否不同,還利用了 Progenesis QI與SPSS軟件進行了差異性檢驗(t檢驗)與差異倍數檢驗(fold change)與變量投影重要性指標(variable importance projection,VIP)以確定顯著差異代謝物。根據差異代謝物的質荷比、保留時間以及二級碎片信息,通過Progenesis QI軟件在HMDB以及KEGG數據庫進行檢索確定其結構是否與標準物質一致。將鑒定無誤的差異代謝物輸入Metaboa Analyst 3.0和KEGG數據庫進行代謝通路的構建。

2 結果與分析、

2.1 甜菜堿作用下大腸桿菌發酵生產蘇氨酸

考察了添加甜菜堿對E.coliTHRD搖瓶發酵產蘇氨酸的影響。發酵過程中菌體的生物量變化情況如圖1-a所示,對照組中最高生物量達到19.05 g/L,與實驗組中最高生物量(20.83 g/L)較為接近,說明甜菜堿的加入不會影響細胞的正常生長。發酵過程中對照組和實驗組的葡萄糖消耗量均為135 g/L,產物積累情況如圖1-b所示,24 h對照組中蘇氨酸的產量和糖酸轉化率分別為50.74 g/L和37.45%,與之相比,實驗組中蘇氨酸的產量和糖酸轉化率則分別為54.59 g/L和40.69%,分別增加了7.58%和8.65%。由此可以看出,甜菜堿的加入能提高E.coliTHRD的發酵產酸能力和糖酸轉化率。

a-細胞干重;b-蘇氨酸產量圖1 甜菜堿添加對大腸桿菌細胞生長和發酵生產 蘇氨酸的影響Fig.1 Effect of glycine betaine addition on cell growth and threonine production of E.coli THRD

2.2 甜菜堿作用下大腸桿菌胞內差異代謝物分析

2.2.1 PCA

根據2.1的實驗結果,選取發酵對數中期12 h以及對數后期18 h作為取樣點,將對照組和實驗組分別標記為Con-12、Con-18、Bet-12和Bet-18,每個組包括6個平行發酵樣本。將質譜測定的胞內代謝物相對含量的數值經標準化和歸一化處理,再使用PCA技術處理后得到正、負離子模式下的PCA得分圖,如圖2所示。PCA是一種無監督的多維統計分析方法,能從總體上反應各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。圖2-a和2-b中各組6個樣本緊密聚集,表明組內重復性好,各組間樣本存在明顯分離狀態,表明組間差異性較大。圖中QC表示控制樣本,QC緊密聚集,說明實驗儀器操作重復性良好,所得數據可靠。

a-正離子模式；b-負離子模式圖2 不同離子模式下的PCA得分圖Fig.2 PCA scoring plots under different ion modes

2.2.2 OPLS-DA

使用OPLS-DA分析正、負離子模式下Con-12和Bet-12,以及Con-18和Bet-18之間的差異代謝物,結果如圖3所示。圖中各組樣本分成明顯的2個群且都位于橢圓(95%的置信區間)內,說明2個組別的代謝物有明顯的差異。負離子模式下OPLS-DA模型的Q2<0.5(圖3-b)，說明該模型對于正離子模式下Con-18和Bet-18之間的差異代謝物的預測能力有限。OPLS-DA模型參數中的Q2>0.5(圖3-c和3-d)，表示模型預測能力較好。

a-正離子模式Con-12 vs Bet-12；b-正離子模式Con-18 vs Bet-18；c-負離子模式Con-12 vs Bet-12；d-負離子模式Con-18 vs Bet-18圖3 不同離子模式下的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA scoring plots under different ion modes

2.2.3 顯著差異代謝物的篩選

結合多元統計分析OPLS-DA的VIP值和單變量統計分析t檢驗P值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物,其中以VIP≥1和P<0.05為篩選標準得到顯著差異代謝物178個,與蘇氨酸合成代謝相關的顯著差異代謝物有28個,分布在糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas,EMP)途徑、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環以及氨基酸代謝途徑,結果如表1所示。

表1 與蘇氨酸合成代謝相關的顯著差異代謝物Table 1 Significant differential metabolites related to threonine biosynthesis

2.3 結合代謝通路解析甜菜堿對大腸桿菌合成蘇氨酸的影響

蘇氨酸屬于天,其合成與葡萄糖中心代謝以及天冬氨酸支路代謝密切相關。蘇氨酸合成是一個高還原力(還原型輔酶Ⅱ,NADPH)需求的過程,而細胞內NADPH主要通過PPP途徑提供,因此葡萄糖向EMP途徑和PPP途徑的代謝流量分配會直接影響蘇氨酸的合成。如圖4所示,Bet-12組6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的相對含量與Con-12組相比分別下降了55%和49%,而6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的相對含量與Con-12組相比分別上升了13%和312%。Bet-18組6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛的相對含量與Con-18組相比分別下降了48%和82%,而5-磷酸木酮糖和4-磷酸赤蘚糖的相對含量與Con-18組相比分別上升了44%和198%。以上結果表明,在蘇氨酸合成期加入甜菜堿對葡萄糖代謝分配的影響是持續性的,葡萄糖流經EMP途徑的代謝通量減弱,而流經PPP途徑的代謝通量增強。細胞通過PPP途徑回補缺失的6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛。這一過程雖然伴隨著碳源的損失,但為蘇氨酸合成提供了充足的NADPH,從而使得Bet-12組和Bet-18組的蘇氨酸相對含量明顯提升。蘇躍穩[16]利用MATLAB軟件考察了甜菜堿對蘇氨酸菌種代謝流分布的影響,發現添加甜菜堿后細胞內葡萄糖流向PPP途徑的代謝流量提高了57.3%。LI等[17]發現甜菜堿的添加能夠提升蘇氨酸菌種6-磷酸果糖脫氫酶的酶活力以及其編碼基因zwf的表達量,6-磷酸果糖脫氫酶催化的反應伴隨著NADPH的形成,因此為蘇氨酸的合成提供了更多的還原力。上述研究結果與本研究代謝組學的分析結果一致。

天冬氨酸作為蘇氨酸合成的重要前體物,是由草酰乙酸接受谷氨酸轉移的氨基形成的,該反應由谷-草轉氨酶催化。細胞內天冬氨酸的合成量與底物草酰乙酸和谷氨酸的供給情況密切相關。從圖4可知,Bet-12組和Bet-18組谷氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別提高了21%和49%,脯氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別下降了25%和77%,說明在蘇氨酸合成期加入甜菜堿有助于增強谷氨酸的合成代謝,弱化谷氨酸的支路代謝,進而為轉氨反應提供充足的底物。在大腸桿菌中,草酰乙酸的供應主要有2種途徑,一種是通過TCA循環,另一種是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的CO2固定反應。Bet-12組乙酰輔酶A、檸檬酸和α-酮戊二酸的相對含量與Con-12組相比分別下降了64%、11%和18%,而琥珀酸和蘋果酸的相對含量與Con-12組相比變化不大,說明在蘇氨酸合成早期加入甜菜堿會減弱草酰乙酸到檸檬酸的代謝,增強磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的代謝。Bet-18組乙酰輔酶A、檸檬酸和α-酮戊二酸的相對含量與Con-12組相比分別上升了307%、49%和44%,而琥珀酸和蘋果酸的相對含量與Con-12組相比分別下降了33%和42%,說明在蘇氨酸合成中后期加入甜菜堿會強化整個TCA循環的代謝通量流向草酰乙酸和谷氨酸。總體來說,甜菜堿加入有助于細胞積累谷氨酸和草酰乙酸用于合成前體物天冬氨酸,從而使得Bet-12組和Bet-18組的蘇氨酸相對含量明顯提升。郭群群[18]研究了甜菜堿對蘇氨酸生物合成關鍵酶活性的影響,發現磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性提高了16.3%,草酰乙酸的合成量有了明顯提高。此外,甜菜堿能夠上調乙酰輔酶A合成酶基因和檸檬酸合成酶基因的轉錄水平,提升TCA循環的代謝通量。上述研究結果與本研究代謝組學的分析結果一致。

圖4 甜菜堿對大腸桿菌胞內代謝的影響Fig.4 Effect of betaine on intracellular metabolism of E.coli THRD 注：圖中白色斜紋條表示不加甜菜堿組,黑色條表示加甜菜堿組；所有的胞內代謝物含量均進行了歸一化處理；代謝物縮寫如下：G1P,1-磷酸果糖;G6P,6-磷酸葡萄糖;6PG,6-磷酸葡萄糖酸;Ribu5P,5-磷酸核酮糖;R5P,5-磷酸核糖;S7P,7-磷酸景天庚酮糖;X5P,5-磷酸木酮糖;E4P,4-磷酸赤蘚糖;F6P,6-磷酸果糖;GAP,3-磷酸甘油醛;PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;Cit,檸檬酸;α-KG,α-酮戊二酸;Suc,琥珀酸;Fum,延胡索酸;Mal,蘋果酸;Oxa,草酰乙酸;Asp,L-天冬氨酸;Lys,L-賴氨酸;Thr,L-蘇氨酸;Ile,L-異亮氨酸;Met,L-甲硫氨酸;Glu,L-谷氨酸;Arg,L-精氨酸;Pro,L-脯氨 酸;Ser,L-絲氨酸;Ala,L-丙氨酸;Val,L-纈氨酸;Leu,L-亮氨酸

大腸桿菌內其他氨基酸的合成會競爭性的影響葡萄糖流經蘇氨酸的代謝通量,因此對其他氨基酸濃度進行監測有助于進一步理解甜菜堿的作用效果。從圖4可知,Bet-12組和Bet-18組絲氨酸的相對含量與Con-12組和Con-18組相比分別下降了22%和25%,說明在蘇氨酸合成期加入甜菜堿會減弱3-磷酸甘油醛向絲氨酸的支路代謝,增加了3-磷酸甘油醛的供給。Bet-18組丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸的相對含量與Con-18組相比變化不大,說明甜菜堿的加入不會顯著影響丙酮酸向這些氨基酸的支路代謝。Bet-18組賴氨酸和異亮氨酸的相對含量與Con-18組相比分別下降了16%和10%,說明甜菜堿的加入會減少天冬氨酸和蘇氨酸的支路代謝,促進蘇氨酸的合成。Bet-18組高絲氨酸的相對含量與Con-18組相比下降了73%,而甲硫氨酸和蘇氨酸的相對含量與Con-18組相比分別提高了60%和276%,說明甜菜堿的加入會促進高絲氨酸的支路代謝,但更偏向于促進高絲氨酸向蘇氨酸的轉化。

3 結論

為了提高蘇氨酸的合成效率,本研究在蘇氨酸發酵過程中加入甜菜堿,并利用代謝組學系統分析了甜菜堿對大腸桿菌合成蘇氨酸的影響。發酵結果表明,甜菜堿的加入能夠明顯提高大腸桿菌的蘇氨酸產量和糖酸轉化率。組學結果表明,甜菜堿的加入能夠改變EMP以及PPP途徑的碳流分配,使得更多的葡萄糖流經PPP途徑為蘇氨酸的合成提供還原力；能夠動態調節磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的CO2固定反應和TCA循環,使細胞能夠積累更多的草酰乙酸和谷氨酸用于合成蘇氨酸；能夠減弱絲氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的合成,減少3-磷酸甘油醛、天冬氨酸以及蘇氨酸的支路代謝。本研究從代謝層面揭示了甜菜堿的作用效果,為甜菜堿在其他工業發酵產品中的應用提供了理論參考。后續研究需要進一步考察關鍵代謝節點處的酶表達以及酶活力變化情況,從分子層面闡明甜菜堿對于大腸桿菌的作用方式和作用機制。