黃腐酚對蛛網膜下腔出血后神經炎癥影響及機制研究

李佳朔， 潘鵬宇， 陳立剛， 鄒 正， 楊新宇， 孔 睿， 李侑埕， 梁國標

北部戰區總醫院 神經外科，遼寧 沈陽 110016

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種發病率高，且病死率高達50%的腦卒中疾病，常伴有永久性的神經功能損傷[1]。有研究表明，早期腦損傷是導致SAH后死亡、殘疾等不良預后的重要原因[2]。炎癥反應、氧化應激損傷、神經元細胞凋亡等在內的病理、生理變化是造成早期腦損傷的主要原因[3]。SAH后過激的炎癥反應刺激炎癥因子激活，通過各種炎癥通路造成腦細胞病理性凋亡，進而造成腦水腫，血腦屏障破壞等諸多損傷[4]。因此，通過抑制SAH后的炎癥反應可以減輕早期腦損傷，保護神經，改善預后。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是PRR家族的一部分，可以識別微生物病原體，激活先天及獲得性免疫反應，引起多種促炎癥細胞因子的表達[5-6]。因此，通過抑制TLR可以發揮抗炎的生物活性。在Toll樣受體的眾多受體中，TLR4是最重要的脂多糖受體[7]。作為TLR4的下游因子，NF-κB同樣具有多種生物活性，如調節炎癥、細胞凋亡及免疫應答[8]。在刺激狀態下，NF-κB通過IκBα的磷酸化及核轉位進行活化，發揮其生物活性[9]。因此，通過TLR4/NF-κB通路抑制TLR4及NF-κB，可以減少炎癥細胞因子表達，發揮抗炎作用。黃腐酚(xanthohumol，XN)是一種異戊二烯基黃酮類物質，具有抗炎、調節凋亡及自噬、抗癌、抗糖尿病在內的多種生物活性[10-11]。這些發現在腦缺血性卒中的研究中也得到了證實[12]。目前，XN在SAH動物模型中的神經保護作用的研究少見報道。本研究旨在探討XN對SAH早期腦損傷動物模型神經炎癥的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性KM小鼠120只，體質量28～30 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號SCXK(遼)2015-0001。實驗小鼠飼養于恒溫室中，每12 h光暗交替1次，日常給予充足的食物和清水，術前自由進食、進水，1周后進行手術。所有實驗動物飼養與處理均嚴格按照“National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”標準進行。將小鼠隨機分為假手術(Sham)組(n=24)、模型(SAH)組(n=24)，XN組(n=72)。將XN組小鼠分為XN 10 mg/kg組，XN 25 mg/kg組，XN 50 mg/kg組，每組各24只，于術前30 min腹腔注射相應劑量的XN。SAH組注射等量的溶劑(0.5% DMSO)。

1.2 實驗試劑 XN質量分數≥97%，購自阿拉丁試劑有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NF-κB p65、p-IκBα、TLR4抗體購自碧云天公司；NeuN抗體購自Abcam公司；白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體購自Santa公司。

1.3 研究方法

1.3.1 建立小鼠SAH模型 運用改良頸內動脈線穿刺法模擬SAH，建立SAH模型[13]。術前腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，充分顯露頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，夾閉頸總動脈及頸內動脈，結扎并剪斷頸外動脈，于起始部剪“V”形口，將尼龍線導入頸內動脈，當有阻力時繼續插入2 mm，迅速退出尼龍線，結扎縫合，置于37℃保溫板上直至恢復。Sham組進行相同手術，但不刺破血管。

1.3.2 SAH嚴重程度評分 根據Sugawara評分標準評價SAH嚴重程度[14]。將基池分為6部分，根據每個節段內的凝塊數量分為0～3級，將6個節段分數相加得出評分。評分越高表示出血量越大，SAH越嚴重。

1.3.3 神經功能評分 術后24 h根據平衡木試驗及改良Garcia評分對小鼠進行神經功能評分，評估小鼠神經功能缺損程度。

1.3.4 腦組織含水量測定 術后24 h進行腦組織含水量測試。將小鼠處死后迅速取出完整的腦組織，稱量其濕重。用110℃烘箱持續烘干72 h，重量不再變化后稱量其干重。

腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%

1.3.5 蛋白免疫印跡法 術后24 h摘取小鼠腦組織，置于冰上迅速研磨勻漿，于4℃靜置30 min，12 000 r/min 4℃恒溫離心10 min取上清液。根據說明書利用BCA試劑盒進行蛋白定量，加入5×loading buffer后100℃恒溫水浴5 min；每孔加入40 μg總蛋白樣品，使用10% SDS-聚丙烯胺進行電泳，濕轉至PVDF膜后5% BSA室溫封閉1 h；加入一抗TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃孵育過夜；次日TBST清洗3次后，1∶800稀釋二抗，室溫孵育1 h，洗膜。利用ECL化學發光法顯示結果。

1.3.6 免疫熒光法 小鼠處死后取新鮮腦組織，于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，于30%蔗糖溶液中脫水，制成冷凍4 mm切片，選用IL-1β(1∶100)，TUNEL細胞凋亡試劑，NeuN(1∶100)于4℃孵育過夜，次日PBS清洗3次，每次5 min。在37℃避光孵育相應二抗60 min后PBS洗滌3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 各組Sugawara評分、神經功能評分、腦組織含水量及免疫熒光結果比較 Sham組Sugawara評分、腦組織含水量低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，平衡木試驗評分、改良Garcia評分高于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異均有統計學意義(P<0.05)。SAH組Sugawara評分高于XN 50 mg/kg組，平衡木試驗評分低于XN 50 mg/kg組，改良Garcia評分低于XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，腦組織含水量高于XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異均有統計學意義(P<0.05)。免疫熒光檢測細胞凋亡結果發現，SAH處理后神經元細胞凋亡增加，XN處理后神經元細胞凋亡減少，XN 50 mg/kg組效果最優。見圖1。

圖1 各組Sugawara評分、神經功能評分、腦組織含水量及免疫熒光結果比較(a.Sugawara評分；b.平衡木試驗評分；c.改良Garcia評分；d.腦組織含水量；e.免疫熒光染色結果)

2.2 各組TLR4蛋白表達情況比較 SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組TLR4蛋白表達水平明顯高于Sham組，差異有統計學意義(P<0.05)。SAH組TLR4蛋白表達水平明顯高于XN 10mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組TLR4蛋白表達情況比較

2.3 各組IκBα、NF-κB蛋白表達情況比較 Sham組IκBα、NF-κB蛋白表達低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統計學意義(P<0.05)。SAH組IκBα、NF-κB蛋白表達高于XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組IκBα、NF-κB蛋白表達情況比較

2.4 各組炎癥因子表達情況比較 Sham組TNF-α、IL-1β表達低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統計學意義(P<0.05)。SAH組TNF-α、IL-1β表達高于XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組炎癥因子表達情況比較

3 討論

SAH是一種危重的臨床急性腦卒中疾病，在發病的患者中，約12.4%的患者立即死亡，約50.0%患者出現不同程度的永久性神經功能損傷，且出血后前幾日的病死率也高達30.0%[15]。早期腦損傷是指SAH后72 h內的一系列病理、生理變化，包括顱內壓升高，血腦屏障破壞，腦水腫，血管痙攣，氧化應激，炎癥等[16]，對患者病死率以及致殘率有著極大的影響。這些最終導致了SAH后的細胞損傷及功能障礙。因此，在SAH發生的早期甚至發生前給予干預可以減輕患者出血后的早期腦損傷，對于改善預后有一定的積極作用。

XN具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、預防腫瘤、保護神經等多種生理作用[17]。TLR是XN發揮其生理作用的最重要作用因子，可調節機體的免疫、炎癥、凋亡等[13-14]。因此，抑制TLR4可以作為一種抑制過激炎癥反應的治療方法。本研究中，SAH處理后TLR4表達水平升高，而隨著XN藥物濃度的升高，TLR4蛋白表達水平逐漸降低，提示XN可以通過抑制TLR4的表達保護神經功能。既往研究發現，激活TLR4可產生轉錄因子NF-κB，進而發揮其重要的生理作用[18]。因此，抑制TLR4可以下調NF-κB，抑制過激的炎癥反應。NF-κB是由Rel蛋白的二聚體組成，具有多種生物活性效應，如調節炎癥、免疫反應、細胞凋亡等[19]。作為調節促炎基因表達的關鍵因子，NF-κB可引起炎性細胞的募集及炎癥因子的釋放[20]。有研究報道，XN可通過NF-κB發揮其抗炎、抑癌等生理作用[21-22]，而NF-κB發揮作用與IκBα的磷酸化、NF-κB磷酸化及核轉位相關[9]。因此，檢測p-IκBα、p-65 NF-κB的表達水平可有效地反映NF-κB的活化程度。本研究發現，XN可以顯著地抑制IκBα磷酸化及p65 NF-κB表達，說明XN可以抑制NF-κB活化程度，而高濃度XN(50 mg/kg)處理后對TLR4有顯著的抑制作用。這提示，XN可以通過抑制TLR4的表達來下調NF-κB活化。

有研究報道，SAH后的炎癥反應在出血發生的24 h內即可發生，其相關的炎癥因子TNF-α、IL-1β均有明顯升高，且由于其具有顯著的細胞毒性、啟動凋亡、破壞血腦屏障等危害，下調相關炎癥因子的表達對神經功能具有正向的保護作用[23]，與本研究結果一致。本研究中，SAH處理后，TNF-α、IL-1β的蛋白表達水平顯著升高，而這種升高會被XN逆轉，且隨著XN藥物濃度的增加，小鼠的出血嚴重程度、神經功能、腦水腫、細胞凋亡均得到改善，提示XN可能通過TLR4/NF-κB途徑抑制SAH后炎癥因子的表達，起到神經保護作用。

綜上所述，XN可以通過抑制TLR4表達進而下調IκBα及NF-κB的磷酸化，降低NF-κB的活化，抑制SAH后的神經炎癥反應，減輕神經損傷，起到保護神經的作用。本研究存在一定的局限性，首先，SAH后的各種腦損傷機制并非相互獨立，而是同時發生，且可以相互作用，而本研究僅分析炎癥這一獨立因素，有一定的局限性；同時，XN是否可以通過其他通路起到緩解炎癥反應的作用還需進一步的研究。