介孔硅固體分散體的制備及載藥性能研究

霍代夏，程丹丹，李瑞娟，劉 佳，顧艷麗，呂曉潔*

（內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特010059）

姜黃素（curcumin，Cur）是姜科植物姜黃中的一種黃色植物多酚，被證實是姜黃的主要活性成分之一，其藥理作用廣泛，毒性低。臨床前研究表明，有抗炎、抗氧化、抗微生物和抗癌等藥理作用[1~3]。但由于其存在水溶性較差（pH 7.4時僅為0.0004 mg/mL）、生物利用度低、不易被機體吸收、快速被清除出體外、光學不穩定、在中性到堿性溶液中極易降解等問題[4]，嚴重限制了臨床應用及相關制劑的開發。為了克服這些缺點，研究者嘗試用各種方法來改善姜黃素的溶解和溶出，包括將其制成納米粒、固體分散體[5]、環糊精包合物、脂質體、膠束、微囊、微球等[6]。介孔二氧化硅（mesoporous silica nanoparticals，MSN）是一種孔徑介于2~50 nm的多孔材料，比表面積大，耐熱性、耐pH、耐機械應力和耐水解的能力均較好，且穩定、低毒[7]。β-環糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）及其衍生物羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）具有“內腔疏水，外部親水”的獨特性質，可以提高藥物的水溶性和穩定性[8]。因其無毒、可降解，可直接用于藥物的增溶，通常用于提高口服和腸外給藥藥物的水溶性[9]。

本研究制備了β-CD、HP-β-CD修飾的介孔二氧化硅載體，進一步以姜黃素為模型藥制成固體分散體，研究其對難溶性藥物姜黃素溶解和體外溶出的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Tecnai G2 F20 200kV場發射透射電子顯微鏡（美國FEI）、S-4800場發射掃描電子顯微鏡（日本日立）、DSC 25差示掃描量熱儀（美國TA）、SZ-100-Z2激光粒度測定儀（日本HORIBA）、TriStar 3020型比表面積及孔徑測試儀（美國Micromeritics）、TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用）、IRAffinity-1傅里葉紅外光譜分析儀（日本島津）、FMC-1000臺式冷凍恒溫振蕩器（東京理化）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華）、ME204/02電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 材料

姜黃素（Cur，HPLC≥98%，四川維克奇）、溴化十六烷基三甲胺（CTAB，≥99%，Biosharp）、硅酸四乙酯（TEOS，99%，安耐吉化學）、β-環糊精（β-CD，醫藥級，曲阜天利）、2-羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD，97%，羅恩試劑）、十二烷基硫酸鈉（SDS，天津凱通化學）、其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 MSN、β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN的制備

稱量1g CTAB，加入480 mL蒸餾水，充分攪拌使其混合均勻，加入3.5 mL NaOH調節pH，加熱使體系穩定在80℃，滴加5 mL TEOS，劇烈攪拌下反應2 h，之后使體系逐漸降溫。離心，用蒸餾水和無水乙醇充分洗滌沉淀，離心棄上清，沉淀置真空干燥箱干燥過夜。鹽酸：甲醇=50：1（V：V）回流去除模板，無水乙醇洗滌，沉淀真空干燥至恒重，得MSN。

稱量1 g CTAB于480 mL蒸餾水中，反應條件同上，在80℃穩定片刻后，先加入7.5 g β-CD或1.15 g HP-β-CD攪拌均勻，再滴加5 mL TEOS，反應2 h，體系逐漸降溫。用蒸餾水和無水乙醇洗滌沉淀，分離沉淀后置真空干燥箱過夜。鹽酸：甲醇=50：1（V：V）回流去除模板，無水乙醇洗滌，沉淀真空干燥至恒重。分別得到β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN。

2.2 載體材料的理化性質

2.2.1 電鏡法觀察形態 將樣品用乙醇分散，滴于銅網，室溫揮干后用透射電鏡觀察不同載體的形貌、粒徑和孔徑。MSN、β-CD-MSN、HP-β-CDMSN形態均為類圓形，粒徑在80~120 nm之間，可見清晰的中孔結構，修飾了β-CD和HP-β-CD的載體粒徑略增大（見圖1）。

圖1 載體的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscope of carriers

2.2.2 粒徑和zeta電位 粒徑是評價納米粒子的一項重要指標，其大小和均勻程度影響納米粒子的體內分布及代謝。zeta電位影響體系的穩定性，電位的絕對值在30~60 mV之間認為體系是穩定的。實驗制備的MSN、β-CD-MSN和HP-β-CD-MSN的粒徑均在120~150 nm，因有水化膜存在，測量得到的粒徑比電鏡觀察到的略大（見表1）。三種樣品在水中zeta電位的絕對值均在30~40 mV之間，表明本課題制備的載體具有較強的電荷斥力，物理穩定性良好。

表1 載體的粒徑和zeta電位值（n=3）Tab.1 Particle size and zeta potential of carriers（n=3）

2.2.3 載體的孔結構參數N2吸脫附常用來測定介孔材料的比表面積及孔徑，根據實驗結果得到的吸附等溫曲線，其形狀與材料孔徑大小、孔類型有關。為了避免水分對測試結果的影響，測試前需先對樣品進行真空干燥，之后在120℃下脫氣，除去材料表面及孔道內部的水分。

由載體材料的吸附等溫曲線可以看出，三種材料均屬Ⅳ型等溫曲線，表現出了介孔結構的特征（見圖2）。當P/P0＜0.2時，由于在樣品表面發生了單分子和多分子層吸附，氮氣的吸附量增加緩慢；P/P0介于0.2~0.4時，低溫下氮氣在樣品孔道發生了毛細管凝聚，相對壓力值迅速增加，圖中有拐點出現，這一現象可證實了樣品中有介孔結構存在；當P/P0介于0.4~0.95時，相對壓力比較穩定，增大不明顯，說明氮氣分子吸附在樣品表面；當P/P0＞0.95時，由于出現樣品內孔道的毛細管凝集現象，曲線出現了較大變化[10]。另外，由于毛細管凝聚，可以觀察到，脫吸附等溫線在吸附等溫線上方，呈現出滯后環。

圖2 載體的氮氣吸附等溫線（A）和孔徑分布曲線（B）Fig.2 Nitrogen absorption isotherms(A)and pore size distributions(B)of carriers

用BJH（Barret-Joyner-Halenda）和BET（Brunauer-Emmett-Teller）法分析孔結構。幾種介孔二氧化硅載體材料均具有較大的比表面積，加入β-CD后的載體材料與MSN相比，比表面積略有增大，孔容積和孔體積略下降（見表2）。加入HP-β-CD后，比表面積、孔容積和孔徑均較前兩者有一定提高。可見用共縮聚法制備環糊精修飾的MSN載體，并沒有堵塞介孔孔道，也未改變介孔材料的基本形態，不同修飾材料對孔徑影響不同。

表2 載體材料的孔結構參數Tab.2 Pore structure paramaters of carriers

2.3 Cur含量測定方法的建立

2.3.1 專屬性考察 精密稱量Cur 2.0 mg，用無水乙醇溶解后，用0.2%SDS稀釋，將MSN、β-CD-MSN和HP-β-CD-MSN用同溶劑稀釋后，在200~700 nm波長范圍內進行掃描。Cur溶液在430 nm處有最大紫外吸收，空白載體在此波長下無吸收，對藥物測量無干擾，專屬性良好，故選擇430 nm為檢測波長。

2.3.2 標準曲線 精密稱量Cur 5.0 mg，用無水乙醇溶解后，加0.2% SDS分別配制成濃度為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg·L-1的對照品溶液，430 nm處測量吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.1901 x+0.0048，R2=0.9995，Cur在0.25~3.00 mg·L-1濃度內呈良好線性關系。

2.3.3 重現性實驗 精密稱取Cur 3.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，0.2% SDS定容至刻度，得到對照品溶液，用0.2% SDS將其稀釋至2.0 mg·L-1，430 nm測量吸光度，重復測定5次，計算RSD為0.72%，該法的重現性良好。

2.3.4 精密度實驗 精確配制Cur低、中、高（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）不同濃度的對照品溶液，同1日內測定5次，計算日內精密度，RSD值為1.17%。同法每日測定1次，連續測定5日，計算日間精密度，計算RSD值為1.82%。表明該法精密度良好。

2.3.5 穩定性實驗 量取2.0 mg·L-1的Cur對照品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10 h后測定吸光度。計算RSD值為1.67%。說明Cur供試品溶液在室溫條件下，10 h內穩定。

2.4 Cur與MSN系列載體固體分散體及物理混合物的制備

分別取50.0 mg MSN、β-CD-MSN、HP-β-CDMSN，室溫狀態下攪拌并抽真空3 h。另取Cur 10.0 mg，溶于10 mL乙醇中，分別加入上述體系中，攪拌3 h使其充分混合均勻。之后打開瓶塞，加熱攪拌，蒸發溶劑至干，真空干燥至恒重。收集干燥粉末研勻，得三種載體與Cur的固體分散體，記為Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD及Cur-HP-β-CDMSN-SD。

Cur和MSN、β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN按照相同比例稱量，置研缽中研勻，過5號篩，即得Cur和不同載體的物理混合物，記為Cur+MSN、Cur+β-CD-MSN及Cur+HP-β-CD-MSN。

2.5 載藥情況考察

2.5.1 掃描電鏡觀察載藥前后形態 分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體制備樣品，用掃描電鏡觀察其形態和結構（見圖3）。Cur外形較為粗糙，藥物分子結晶較大且不均勻（見圖3-A）；三種空白載體的電鏡圖片差別不大，在放大3 k倍的視野下觀察，載體均團聚成堆（見圖3-B）；Cur與三種載體的物理混合物電鏡圖片幾乎無差別，在相同的分散條件和放大倍數下，載體附著在藥物晶體表面，未改變藥物晶體的大小，物理混合物均顯示了藥物和載體的共同特點，二者可清晰區分（見圖3-C）；三種固體分散體的電鏡圖片顯示，Cur-MSN-SD（圖3-D）和Cur-β-CD-MSN-SD（見圖3-E）呈小塊聚集狀，大小不均，視野中幾乎見不到完整的藥物晶體，無法清晰辨別介孔硅材料和Cur，其微觀形態與物理混合物不同，分散程度較Cur和物理混合物均有改善。但Cur-HP-β-CD-MSN-SD（見圖3-F）仍然可見藥物晶體。

圖3 樣品的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of samples

2.5.2 差示掃描量熱法（differential scanning calorimeter，DSC）DSC是將樣品和參比物在同等環境中程序升溫及降溫，通過測量二者溫差為零時所須補償的熱量來判斷藥物晶體的含量，晶體越多，得到吸熱峰的面積越大。

分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體各樣品適量，在掃描溫度50℃~300℃，升溫速度10℃·min-1的條件下進行DSC分析。得到原料藥在181℃時有尖銳的吸熱峰，對應Cur的熔點，物理混合物也在同樣的位置有吸熱峰。Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD幾乎沒有峰，而Cur-HP-β-CDMSN-SD在同樣的位置顯示出了吸熱峰（見圖4）。說明模型藥在Cur-HP-β-CD-MSN-SD中只有少部分以無定型的形式存在，而在另外二種材料的固體分散體中藥物的形態發生了變化，絕大部分以無定型狀態存在。

圖4 樣品的DSC曲線Fig.4 Differential Scanning Calorimeter curves of samples

2.5.3 紅外分析 分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體適量，與溴化鉀粉末研磨均勻后壓片，測定其紅外光譜（見圖5）。Cur分子結構中主要有苯環、-OH、C=O、-OCH3及C=C等。曲線a為Cur的特征吸收峰，3503 cm-1處可歸屬為酚羥基伸縮振動，1627 cm-1處為C=O雙鍵的伸縮振動，C-O-C的振動峰位于1025 cm-1處；b、c、d空白載體表現出了MSN的特征吸收峰，804 cm-1、1095 cm-1處的峰可歸屬為對稱和不對稱Si-O-Si伸縮振動，468 cm-1和968 cm-1處分別為Si-O-Si彎曲振動和Si-OH表面的伸縮振動，2856 cm-1處的吸收峰歸屬為CTAB中CH3和CH2的伸縮振動。e、f、g分別為空白載體與Cur物理混合物的紅外曲線，仍清晰可見藥物的特征吸收峰。h、i、j分別為三種固體分散體，Cur的特征吸收峰部分被掩蓋，可能由于藥物進入載體晶型轉變所致，且未發現新的特征峰，說明Cur與載體材料間僅有物理吸附作用，未產生新的物質。

圖5 樣品的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of samples

2.6 藥物溶解度的測定

稱取過量的Cur、Cur-MSN、Cur-β-CD-MSN和Cur-HP-β-CD-MSN，于0.2% SDS中，室溫下避光，充分振搖至溶解平衡。取溶液過0.22 μm微孔濾膜，用紫外可見分光光度計在430 nm處測量吸光度。

通過測量得到，Cur在0.2% SDS中的溶解度為（22.15±1.30）mg·L-1，Cur-MSN-SD、Cur-β-CDMSN-SD和Cur-HP-β-CD-MSN-SD在相同溶劑中的溶解度分別為（312.78±8.15）mg·L-1、（172.93±3.75）mg·L-1、（27.90±1.81）mg·L-1。Cur-MSN-SD比原料藥的溶解度高了約15倍，Cur-β-CD-MSN比原料藥的溶解度高了8倍多，而Cur-HP-β-CDMSN與原料藥基本持平。可見不同載體材料的固體分散體對于Cur的增溶效果不同，其中MSN作為載體制備的固體分散體增溶效果最好。

2.7 體外溶出度的測定

取Cur、Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD和Cur-HP-β-CD-MSN-SD適量，使Cur含量保持相同，以0.2% SDS溶液作為溶出介質，于（37±0.5）℃，120 rpm振搖。分別于0、5、10、20、30、60、120、240、360 min取樣，取樣后立即補充等體積、同溫的溶出介質。采用紫外-可見分光光度法在430 nm處測定不同時間下藥物的溶出量。計算Cur的累積釋放率，并繪制釋放曲線（見圖6）。

圖6 樣品的體外溶出曲線Fig.6 In vitro release curves of samples

據文獻報道[11]，SDS對降低Cur的水解，保持其穩定的作用較強，因此實驗選擇0.2%SDS作為溶出介質。從體外釋放結果可見，Cur在0.2% SDS中幾乎不能溶出，300 min的溶出率在1%以下。在相同的條件下，Cur-MSN、Cur-β-CD-MSN和Cur-HPβ-CD-MSN均有不同程度的溶出，但不同載體增加溶出的效果不同，與Cur相比，Cur-β-CD-MSN-SD的累積溶出效果最好，Cur-MSN-SD次之，Cur-HPβ-CD-MSN剛開始表現出了突釋的現象，隨著時間的延長，其增加溶出的效果較差。

3 討論

得益于介孔二氧化硅特殊的表面性質，將其作為載體與藥物制成固體分散體后，可以抑制藥物晶型轉化，并將藥物限制在納米級尺寸，使藥物保持相對易溶的無定型或亞穩定狀態。介孔硅表面的硅羥基本身有一定的親水性，能與-OH、-NH2等末端基團的分子形成分子內氫鍵，改善藥物潤濕性，減小接觸角，增加溶出速率；載體巨大的比表面積增加了藥物與溶出介質的接觸，利于載藥體系吸附在胃腸黏膜表面并滯留，促進了藥物吸收。有文獻報道[11]，介孔二氧化硅材料制備的固體分散體可將藥物限制在非晶態，室溫下保存兩年仍然是穩定的。β-CD分子內空腔大小適中，應用廣泛，對其2位羥丙基修飾得到HP-β-CD，在不改變其獨特結構的基礎上，分子具有更強的不對稱性，羥丙基的引入可以改變環糊精的極性和親水性。

根據不同的介孔硅材料制備的固體分散體增加Cur溶解和體外溶出的效果推測，由于藥物轉變成了無定型狀態，加之載體巨大的比表面積，使藥物迅速分散于介質中，溶劑的浸潤能力增加。但不同載體由于表面性質、孔徑孔容大小，對Cur溶解和體外溶出增加效果不同。Cur-MSN的平衡溶解度最高，但在體外溶出實驗中，β-CD-MSN-SD的釋放最快，累積釋放率也最高。而Cur-HP-β-CD-MSNSD復合樣品一接觸溶出介質即達到較大的溶出量，但隨著時間的延長，釋放量下降，對累積釋放增加的效果不明顯。推測可能是由以下幾個原因造成的，首先，HP-β-CD-MSN的孔徑最大，較大的孔隙更容易被加載流體接觸，且容易使藥物重新生成結晶物質。另外，當分子被釋放時，吸附的第一個單分子層由于作用力更強，更難解吸，會導致一部分藥物留在載體中[12]。MSN和β-CD-MSN表面性質的差異，使其表現出了不同的溶出行為。材料高表面自由能和表面硅烷醇的高反應活性也可能導致藥物釋放不完全[13]；修飾基團的鍵能差別，也會造成材料和藥物的穩定性不同[14]；調節載體的親/疏水性能，藥物的釋放量也會隨之變化，疏水性材料的藥物釋放更少[15]。

用介孔硅作為固體分散體，可以提高難溶性藥物的溶解和溶出，但MSN與難溶藥物之間的相互關系并不明確，不同種類的載體如何影響藥物溶解、釋放，如何準確地選擇載體仍有一定的盲目性，且藥物在體內的釋放情況也有待進一步確證，但介孔硅在生物相容性及毒副作用方面表現出的優勢和在提高難溶性藥物溶解度方面的潛力值得我們進一步探究。