蒙古族并指一家系臨床特點及其HOXD13基因突變檢測

呼斯勒，喜吉日，楊立清，曹亞寧，吳柒柱

（1.內蒙古民族大學附屬醫院口腔科，內蒙古 通遼028000；2.內蒙古自治區個體化用藥工程技術研究中心；3.錫林郭勒盟蒙醫醫院；4.內蒙古大學 生命科學學院）

并指畸形（Syndactyly，SD）是指相鄰指（趾）間軟組織和（或）骨骼不同程度的融合并肢體分化障礙導致，發生率約為兩萬分之一，其中雙側性并指占二分之一。SD為主要以常染色體顯性方式遺傳，并呈現不完全外顯率，少數為常染色體隱性和X-連鎖隱性方式遺傳[1，2]。SD具有明顯的表型差異和遺傳異質性，具有單側或雙側、對稱或不對稱等特點[3]。HOXD13基因在肢體發育中起關鍵調控作用[4]。HOXD13轉錄因子含有1條多聚丙氨酸鏈和1個同源DNA結合結構域，前者延展突變和后者錯義突變都可引起SD表型[5]。本文報道了內蒙古地區發現的蒙古族SD一家系臨床特點及HOXD13基因錯義突變檢測結果。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例 先證者（Ⅱ4），女，65歲，2014-03首次在內蒙古民族大學附屬醫院進行遺傳咨詢。臨床表現為先天性單側（左手）3/4手指融合，雙腳趾正常，無其它疾病。

1.1.2 家系資料 該家系位于內蒙古東部鄉村，已傳4代，可追溯調查38人（見圖1），其中并指患者9例（4例男性，5例女性患者）。臨床表型為Ⅱ4，Ⅲ5，7，10為單側3/4手指融合，雙側腳趾正常。Ⅲ16和Ⅳ3，6，7等均為雙側3/4手指融合，雙側腳趾正常（見圖2）。其中Ⅲ16嬰幼兒期在鄉村傳統方法進行手指分離手術，預后效果不佳；Ⅳ6，7等二名患者在5～12歲之間在內蒙古民族大學附屬醫院手足外科做過手術，預后良好，臨床（見圖2、表1）。

表1 家系受累成員的臨床特征

圖1 并指一家系系譜圖

圖2 家系患者并指（趾）圖片及X光片

對于該項目的倫理論證由內蒙古民族大學附屬醫院倫理委員會認可，在所有受調查者均簽署知情同意書后對該家系成員進行了病史采集、X光片拍攝、身體檢查和生活習慣調查等，并抽取外周血10 mL分別兩個EDTA抗凝管中保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 應用酚-氯仿法從血液中提取基因組DNA，應用Qubit 3.0對DNA濃度進行定量、瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白質污染。

1.2.2 家系樣本外顯子測序分析 外顯子測序分析由諾禾基因Illumina novaseq平臺完成。具體操作步驟為基因組DNA→文庫構建→外顯子捕獲和富集→外顯子測序→堿基識別和reads生成→序列比對→變異識別及分析→注釋→候選基因及突變的篩選。本實驗選取先證者在內的6位家系成員（包括三名患者Ⅱ4、Ⅲ10、Ⅳ7；兩名正常人Ⅲ2，13和一名致病基因攜帶者Ⅲ12）進行全外顯子測序并進行關聯分析，捕獲候選基因致病突變位點。

1.2.3 候選基因突變位點PCR擴增及Sanger測序驗證 將外顯子測序分析后得到的手指發育相關的6個疑似致病基因為目標，對已獲得樣本的所有家系成員進行PCR擴增和Sanger測序驗證，確定該位點在家系患者和正常人之間的并指表型的共分離情況。HOXD13的突變位點的擴增引物序列和反應條件如下，其余5個基因引物序列及基因信息見附表1：

上游引物（HOXD13-F）：5'-CTGCACCCCTGCAAACGCAC-3'；

下游引物（HOXD13-R）：5'-GCTGTCTGTGGCCAACCTGG-3'。

PCR擴增條件如下：

PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger測序。

2 結果

2.1 家系調查與臨床特點

該蒙古族家系可追溯調查38人，已傳4代，受累患者共9名，其中男性4例、女性5例，每代均有患者出現，男女發病概率相等，屬于常染色體顯性遺傳模式。可追溯調查到的8名患者以及家系主要成員進行了系統的身體檢查：手腕、腳踝、肘/膝關節、髖關節和頸部活動正常，五官和身高正常。臨床表型為Ⅱ4，Ⅲ5，7，10為單側3/4手指融合，雙側腳趾正常。Ⅲ16和Ⅳ3，6，7等均為雙側3/4手指融合，雙側腳趾正常。

2.2 致病基因研究

2.2.1 外顯子測序結果 先證者在內的6名家系成員（3名患者、1名疑似致病基因攜帶者和2名正常人）進行外顯子測序，共篩選出6個指（趾）發育相關候選基因，即FBN2、FMN1、FREM2、HOXD13、LRP4、MYO10基因。其中，HOXD13基因第二外顯子917位點發生G>A的突變（HOXD13，c.917G>A，p.R306Q）與3名患者和1名無臨床表型的攜帶者（Ⅲ12）均有此突變，家系2名正常成員無此突變，臨床表型共分離。其余5個基因突變位點在3名患者和無臨床表型攜帶者中出現不一致，無表型共分離現象。

2.2.2 候選基因驗證結果 將外顯子測序分析后得到的6個疑似致病基因為目標，對該家系其他成員進行PCR擴增和Sanger測序驗證，結果為該家系中所有患者和攜帶者均有HOXD13，c.917G＞A雜合突變，正常人無此突變，顯示表型共分離，表明該家系并指致病基因為HOXD13，c.917G>A，p.R306Q。其余5個基因突變在患者和攜帶者中出現不一致，表型無共分離現象，排除此5個基因為該家系并指致病基因。

HOXD13，c.917G＞A突變位點的PCR擴增結果（圖3），所有樣本均得到了目的DNA片段（目的片段長度388 bp）。PCR產物經Sanger測序，結果表明HOXD13，c.917G＞A在患者和攜帶者均出現此突變，正常人無次突變，具有共分離現象（見圖4）。

圖3 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物

圖4 Sanger測序驗證結果

3 討論

并指（趾）畸形（syndactyly，SD）是在肢體發育過程中異常導致的相鄰手指或腳趾部分或完全融合。SD臨床表型有很大差異，受累單側或雙側，皮膚性融合或骨性融合。輕度表現為皮膚紋理的異常，重度為骨性融合，涉及指骨、掌骨或跖骨，更嚴重的延伸到腕骨或跗骨[5，6]。

我國2011～2017年報告的手指（趾）異常總檢出率為12.93/萬～16.43/萬[2，7]。本研究在內蒙古東部鄉村發現了一蒙古族并指家系，該家系已傳4代，每代都有患者出現，男女發病機會均等，屬于常染色體顯性遺傳病。臨床表型存在異質性，為單側或雙側3/4手指皮膚/骨性融合，腳趾均為正常，屬于并指/趾Ic型。家系患者第二代（Ⅱ4）1人和第三代3人（Ⅲ5，7，10）為單側3/4手指皮膚/骨性融合，第三代（Ⅲ16）1人和第四代全部（Ⅳ3，6，7）為雙側3/4手指皮膚/骨性融合。患者Ⅳ7的母親Ⅲ12沒有臨床表型，但檢測結果顯示為致病基因突變攜帶者，存在外顯率不全特點。

研究認為SD由胚胎發育時期手板分化缺陷所致[8]。胚胎發育中成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）引導手板伸長，而手板分化出指（趾）的數量和特征由胚胎極化活性區（Zone of polarizing activity，ZPA）細胞分泌的SHH因子與同源盒基因（Homeobox gene，Hox）表達的HOX轉錄因子相互作用決定，該發育過程相關基因致病性突變可導致并指（趾）畸形的發生。

根據Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）的數據，已有287個基因突變與并指（趾）畸形相關。臨床上，HOXD13基因突變與家族性并指（趾）畸形相關性最高。HOXD13基因有兩個外顯子：外顯子1編碼含15個丙氨酸殘基的多聚丙氨酸鏈；外顯子2編碼含有60個氨基酸殘基的同源盒結構域。HOXD13基因的第二外顯子917位點發生G>A的突變，導致306位精氨酸變為谷氨酰胺（HOXD13，c.917G>A，p.R306Q），使HOXD13轉錄因子的同源盒結構域構象改變，不能結合特定的DNA序列，因而不能調控早期肢體前-后軸發育關鍵基因轉錄[9～12]。這是該蒙古族家系導致并指畸形的主要原因。該家系中不同患者不規則出現FBN2、FMN1、FREM2、LRP4、MYO10等5個基因突變現象，這些基因突變也有可能與主基因互作、基因修飾以及表觀遺傳等因素導致家系患者具有臨床表型異質性和外顯率不全等現象，有待進一步基因功能研究。

本研究通過家系分析和基因檢測，進一步驗證了HOXD13，c.917G>A，p.R306Q突變導致并指畸形的發生，為遺傳咨詢和產前診斷提供了依據。