人結腸癌組織中VM、EMT及Wnt通路關鍵蛋白表達的相關性分析

楊 宏，喬 夢，李皓靜，杜家樂，陳速研，羅丹陽，何 敏，張翠英

（1.內蒙古自治區人民醫院腫瘤內科，內蒙古 呼和浩特010017；2.內蒙古醫科大學）

結腸癌嚴重危害人類健康，腫瘤血管生成是結腸癌侵襲轉移不可或缺的因素。最新研究表明血管生成擬態（Vasculogenic Mimicry，VM）與腫瘤細胞的生長轉移密切相關[1]。已有研究表明結腸癌組織中存在VM現象且存在VM的患者往往惡性程度高，易發生血道轉移，預后差。VM形成的具體機制未完全明確，有研究認為上皮間質轉化（epithelial.mesenchymal transition，EMT）在VM形成過程中發揮重要作用[2]。EMT是上皮細胞向間充質細胞轉化的現象，會受到細胞信號轉導機制精準調控，其中Wnt通路被認為是參與調控EMT的重要信號通路之一[3]。然而VM形成與Wnt通路是否存在關聯仍不清楚。另外結腸癌中Wnt通路與EMT關系仍需驗證。本研究通過免疫組化技術分別檢測結腸癌病例組織中VM表達，同時檢測EMT的標記蛋白Vimentin和E-cadherin的表達，檢測Wnt通路調控蛋白βcatenin的表達。初步分析和研究結腸癌VM表達情況以及VM表達與臨床病理特征的關系；分析VM與EMT兩種標記蛋白表達的關系；分析VM與Wnt通路調控蛋白β-catenin表達的關系；分析β-catenin表達與EMT兩種標記蛋白的關系，為進一步研究VM、EMT以及Wnt通路這三者之間的內在聯系奠定初步基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018-01～2019-12期間我院收治的200例結腸癌患者的組織標本，所有入組患者均接受手術治療，排除術前接受過放化療的患者。患者中包括男性109例，女性91例，年齡范圍25～74歲，平均年齡為（50.61±18.3）歲。收集所有患者臨床病理資料，另由兩位有經驗的病理醫師復閱切片并確認為結腸癌。

1.2 方法

采用CD34免疫組化染色與過碘酸-雪夫氏（PAS）染色法兩種方法共同判定VM，PAS陽性且周圍襯有腫瘤細胞，但CD34為陰性的管道結構被認為是VM（+），400倍鏡下觀察至少10個不同的視野判斷結果[1]。

免疫組化SP染色測定EMT相關因子Vimentin、E-cadherin的表達，陽性染色結果判定：Vimentin＞10%，E-cadherin＞50%為陽性表達[4]。

免疫組化染色判定Wnt通路相關因子βcatenin表達情況。結果根據IRS系統進行評價：IRS（分值）=染色程度（SI）×陽性細胞比例（PP）。評判標準：0分，陰性，記為（-）；1分以上陽性，記為（+）[5]。

1.3 統計學方法

本研究采用SPSS 22.0軟件，計數資料采用χ2檢驗；計量資料采用表示，采用t檢驗；檢驗水準為α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人結腸癌組織中VM表達情況分析

共檢測200例結腸癌患者術后組織蠟塊的VM表達情況。結果顯示，結腸癌患者中的確存在VM現象，本研究200例結腸癌中有45例VM表達（+），且陽性表達者與較差的腫瘤組織分化、較高的臨床分期及復發轉移相關，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 結腸癌組織VM蛋白表達情況及臨床特征關系（n）

2.2 人結腸癌組織中VM蛋白和EMT蛋白表達的相關性分析

本研究45例VM陽性的結腸癌組織中Vimentin為高表達率（66.7%），E-cadherin為低表達（15.5%）；而VM陰性中Vimentin為低表達（14.8%），E-cadherin為高表達（74.8%），（見表2）。統計學分析顯示VM陽性組與陰性組中結腸癌細胞Vimentin和Ecadherin的表達差異均有統計學意義（P<0.05），提示存在VM的結腸癌組織中腫瘤細胞多發生EMT，二者具有相關性。

表2 VM與EMT標記蛋白表達之間的關系[n(%)]

2.3 人結腸癌組織中VM陽性與Wnt通路調控蛋白β-catenin表達的相關性分析

本研究45例VM陽性的結腸癌組織中，有27例（60%）β-catenin表達陽性，而VM陰性中只有13例（8.4%）β-catenin表達陽性（見表3）。VM表達在βcatenin陽性與陰性組的表達具有統計學差異（P<0.05）。提示VM表達與Wnt通路調控蛋白βcatenin表達具有相關性。

表3 VM表達與β-catenin表達的相關性[n(%)]

2.4 人結腸癌組織中β-catenin表達與EMT的兩種標記蛋白（Vimentin、E-cadherin）表達的相關性分析

200例結腸癌組織中有40例β-catenin陽性，Vimentin為高表達（72.5%），而E-cadherin低表達（30.0%）；而β-catenin陰性中，Vimentin低表達（15.0%）而E-cadherin高表達（69.4%）（見表4）。經統計學分析表明β-catenin與Vimentin表達呈正相關（P<0.05），同時與E-cadherin呈負相關（P<0.05）。提示β-catenin陽性者更易發生EMT。

表4 Wnt/β-catenin信號通路狀態有關蛋白和EMT蛋白表達的關系[n(%)]

3 討論

美國學者于1999年首次在黑色素瘤的報道中提出了VM[6]現象，這種特殊現象在多種腫瘤中都可以觀察到[7]。由于VM管道由腫瘤細胞直接圍成因此腫瘤細胞更易突破基底膜快速進入血液利于腫瘤侵襲和轉移[8，9]。一項納入217例結腸癌患者的研究顯示VM與腫瘤組織分化程度低、TNM分期晚以及高復發轉移密切相關[10]。本研究結果顯示，200例結腸癌組織中有45例VM陽性。其中VM陽性與結腸癌患者的年齡、性別以及腫瘤大小無明顯相關，但與腫瘤分化差、臨床分期晚及高復發轉移密切相關（P＜0.05），這與既往研究結果一致。

上皮間質轉化（EMT）與癌組織的VM關系密切。EMT發生過程中上皮細胞失去其上皮表型如E-cadherin、claudin等粘附蛋白表達下調導致細胞間橋粒連接減弱，同時獲得間質特性如Vimentin、SMA等表達上調。本研究檢測和比較了結腸癌組織中VM與EMT的兩種標記蛋白Vimentin和Ecadherin的表達。VM陽性組Vimentin高表達而Ecadherin表達缺失，提示VM存在的結腸癌組織中癌細胞間充質表型上調而上皮表型缺失，因此推測VM陽性結腸癌更容易發生EMT。

Wnt通路是調控EMT的重要信號通路之一[11]，既然EMT參與腫瘤VM形成那么VM與Wnt通路是否相關值得關注。Wnt信號通路的激活在腫瘤發生中至關重要[12]。研究表明Wnt通路異常會引起血管發育異常和血管生成[13]。本研究初步分析VM與Wnt通路的調控蛋白β-catenin的關系，結果提示二者呈正相關，提示VM與β-catenin調控的Wnt/βcatenin信號通路之間可能具有相關性。

EMT在惡性腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用[14]。許多研究報道Wnt通路與EMT的發生密切相關[15，16]。為了驗證結腸癌組織中Wnt通路與EMT的關系，本研究初步分析該信號通路的調節蛋白β-catenin與EMT的兩個標記蛋白（Vimentin）、Ecadherin）表達的相關性。結果提示β-catenin調控的Wnt信號通路活化可能引起結腸癌細胞間質表型（Vimentin）上調和上皮表型（E-cadherin）下調，即β-catenin陽性更容易發生EMT。

綜上所述，在結腸癌組織內存在VM現象，且VM陽性的結腸癌患者分化更差、臨床分期更晚，更易發生復發轉移。VM與Vimentin表達呈現正相關，與E-cadherin為負相關，提示VM與EMT密切相關。同時VM與Wnt信號通路的調控蛋白β-catenin表達呈正相關，提示VM與Wnt通路之間存在相關性。另外β-catenin與Vimentin表達為正相關但與E-cadherin負相關，提示結腸癌中Wnt通路異常活化可能促進EMT發生。本研究為進一步研究結腸癌組織中VM、EMT、Wnt通路三者之間的內在聯系奠定了初步基礎。