結核分枝桿菌相關γ-干擾素檢測聯合結核桿菌DNA、結核抗體檢測對菌陰肺結核陽性檢出率的影響

胡月紅

[摘要]目的研究結核分枝桿菌相關γ-干擾素（TB-IGRA）檢測聯合結核桿菌脫氧核糖核酸（TB- DNA）、結核抗體（TB-Ab）檢測菌陰肺結核患者對陽性檢出率的影響。方法選取2019年3月至2020年3月廈門大學附屬第一醫院菌陰肺結核疑似患者158例，均行 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 檢測，以組織培養及病理檢查為“金標準”，統計 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測、兩兩結合、三者聯合檢測菌陰肺結核陽性的診斷結果，并比較診斷效能（靈敏度、特異度、準確度）。結果 TB-IGRA 檢測肺結核真陽性81例，真陰性31例;TB-DNA 檢測真陽性60例，真陰性36例;TB-Ab 檢測真陽性73例，真陰性30例;TB-IGRA + TB-DNA 檢測真陽性91例，真陰性27例;TB-IGRA + TB-Ab 檢測真陽性87例，真陰性29例;TB-DNA + TB-Ab 檢測真陽性95例，真陰性28例;TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者聯合檢測肺結核真陽性108例，真陰性25例;TB-IGRA 檢測肺結核靈敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 檢測（ P <0.05）;三者聯合診斷的靈敏度、準確度高于兩兩聯合診斷，而兩兩聯合診斷的靈敏度、準確度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測，差異有統計學意義（ P <0.05）。結論 TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 三種方法聯合檢測能提高菌陰肺結核患者診斷效能，有助于臨床合理治療方案的制訂，具有良好應用價值。

[關鍵詞]結核分枝桿菌相關γ-干擾素檢測;結核桿菌 DNA 檢測;結核抗體檢測;菌陰肺結核;陽性檢出率

[中圖分類號] R521; R446.6? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2021）23-0146-05

Influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ detection combined with Mycobacterium tuberculosis DNA and tuberculosis antibody detection on positive detection rate of bacterial negative pulmonary tuberculosis

HU? Yuehong

The First Affiliated Hospital of Xiamen University， Fujian， Xiamen 361003， China

[Abstract] Objective To study the influence of Mycobacterium tuberculosis-related interferon-γ（TB-IGRA） detection combined with Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid （TB-DNA） and Tuberculosis antibody （TB-Ab） detection on the positive detection rate of patients with bacterial negative pulmonary tuberculosis （PTB）. Methods A total of 158 suspected patients with bacterial negative PTB in the First Affiliated Hospital of Xiamen University from March 2019 to March 2020 were selected and they were detected for TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab. Taking tissue culture and pathological examination as the "gold standard"， the diagnostic results of single detection， pairwise detection and combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were counted， and the diagnostic efficiency （sensitivity， specificity and accuracy） were compared. Results TB-IGRA detection showed that 81 cases were true positive and 31 cases were true negative. TB-DNA detection informed us of true positive in 60 cases and true negative in 36 cases. TB-Ab detection demonstrated that 73 cases was true positive and 30 cases was true negative. TB-IGRA + TB-DNA detection showed positive in 91 cases and negative in 27 cases. TB-IGRA + TB-Ab detection showed true positive in 87 cases and true negative in 29 cases. TB-DNA + TB-Ab showed true positive in 95 cases and true negative in 28 cases. TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab were combined to detect 108 cases of true positive and 25 cases of true negative PTB. TB-IGRA was slightly more sensitive than TB-DNA and TB-Ab （P <0.05）. The sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of the three methods were higher than those of the combined diagnosis of pairwise detection， while the sensitivity and accuracy of the combined diagnosis of pairwise detectionwere higher than those of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab alone， with statistically significant differences （P <0.05）. Conclusion The combined detection of TB-IGRA， TB-DNA and TB-Ab can improve the diagnostic efficiency of patients with bacterial negative PTB， and contribute to the formulation of rational clinical treatment plan， which has good application value.

[Key words] Detection of Mycobacterium tuberculosis related interferon-γ; Tuberculosis DNA detection; Tuberculosis antibody detection; bacterial negative pulmonary tuberculosis; Positive detection rate

肺結核是臨床常見慢性傳染疾病，在全球范圍內特別是發展中國家具有較高發病率，我國結核病新發患者近88.9萬，發病率為63/10萬，臨床診治關鍵是早期準確診斷與隔離治療[1]。而對于三次痰涂片與一次培養均為陰性的菌陰肺結核臨床診斷難度較大，極易出現誤診漏診情況，因此尋求更準確方法以快速早期診斷結核病對其防治效果具有重要意義[2]。實驗室檢測指標對肺結核診斷具有重要意義，其中結核分枝桿菌相關γ-干擾素（TB- IGRA）是通過檢測受結核分枝桿菌特異性抗原刺激而活化的效應 T 細胞來診斷結核感染，可用于結核分枝桿菌活動感染或潛伏感染的輔助診斷[3]。通過聚合酶鏈式反應（PCR）測定結核桿菌脫氧核糖核酸（TB-DNA）能直接判斷結核桿菌診斷效果[4];而結核抗體（TB-Ab）是通過檢測血清中 IgG 或 IgM 抗體間接反映結核桿菌陽性情況。本研究選取廈門大學附屬第一醫院菌陰肺結核疑似患者158例，旨在探討 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 聯合檢測的價值。現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

經我院醫學倫理委員會批準，選取2019年3月至2020年3月我院菌陰肺結核疑似患者158例，其中男82例，女76例;年齡21～74歲，平均（49.68±12.01）歲;體質量指數（BMI）18.2～25.4 kg/m2，平均（22.43±1.19）kg/m2。

1.2納入及排除標準

納入標準：均符合《肺結核基層診療指南（2018年）》中相關診斷標準[5];均伴有咳嗽咳痰、全身疲乏、體重下降等臨床表現;均接受 X 線胸部攝片，存在團塊狀陰影;精神或意識清晰可配合正常檢查治療;均簽署知情同意書。排除標準：合并其他呼吸系統疾病;凝血功能障礙;合并惡性腫瘤、傳染性疾病;既往接受過抗結核藥物治療;合并嚴重心肝腎等重要臟器功能障礙。

1.3方法

1.3.1 TB-IGRA 檢測采用靜脈穿刺術采集全血標本4 ml，顛倒混勻后分裝到“N”“T”“P”三種培養管中，1 ml/管，并于37℃培養（22±2）h，然后以3000 r/min 的速度離心10 min，取血漿進行酶聯免疫吸附法檢測;定量檢測 IFN-γ，將濃縮洗滌液用蒸餾水進行20倍稀釋，充分溶解后得到400 pg/ml 的校準品，然后進行稀釋，最終得到的校準品濃度分別為400、200、100、50、25、12.5 pg/ml;將樣品對應微孔按序編號，每個受試者的3種培養血漿各1孔，校準品各雙孔，空白對照1孔;分別在相應孔中加入20μl 樣品稀釋液（除空白對照孔）;分別在相應孔中加入50μl 待測樣品或校準品（除空白對照孔），震蕩混勻，用封板膜封板后，置37℃下溫育60 min;然后每孔加入50μl 酶標試劑（除空白對照孔），輕輕震蕩混勻，封板后置37℃下溫育60 min，揭掉封板膜采用洗板機洗滌5遍;然后每孔各加入50μl 顯色劑 A、B 液，振蕩混勻，于37℃避光顯色15 min;每孔加50μl 終止液，振蕩混勻，10 min 內采用酶標儀波長于450 nm 處檢測，并用空白孔調零點后測定各孔 A 值。陽性結果判定標準[6]：N 值≤400、P-N 為任何值、T-N ≥14并且≥ N/4時為陽性，提示患者感染結核分枝桿菌。

1.3.2 TB-DNA 檢測采用廈門致善生物科技股份有限公司提供的儀器，并嚴格按照操作步驟進行，將痰處理液或4%氫氧化鈉以痰液體積的1～2倍加入痰液中，觀察痰液黏稠程度，并混合震蕩，30 min 消化至水樣;取1 ml 樣本于1.5 ml 離心管中，并在管蓋上進行標記;以13000 r/min 的速度離心5 min 后，棄去上清液，再取1 ml 樣本置于1.5 ml 離心管中，重復0～2次后富集步驟可觀察到沉淀物，取500μl TB-DNA 提取液至1.5 ml 離心管，然后將沉淀物混勻重懸;離心管置于金屬干熱儀上，設置99℃滅活10 min;準備試劑條，在左邊第1孔中加入20μl 增強液及預處理樣本，并在第10孔右沿空白處標記編號，儀器運行結束后，取左邊起第10孔為純化 DNA 溶液，置入離心管中，標記編號備用;然后以13000 r/min 的速度離心5 min，若觀察到沉淀物則取上清，轉移至新的1.5 ml 離心管中再保存。

1.3.3 TB-Ab 檢測①采用膠體金法測定結核分枝桿菌的 IgG 抗體，首先在反應孔內加入1滴緩沖液，完全滲入后加入150μl 待測血清，然后加入金標液3滴，最后加洗滌液3滴，于3 min 內觀測結果。若 T 區出現紅色印跡則為 IgG 抗體陽性，T 區未出現紅色印跡為 IgG 抗體陰性。②采用酶聯免疫吸附法（ELISA）法測定結核分枝桿菌的 IgM 抗體，分別加入稀釋液100μl、標本5μl，于37℃下溫浴10 min，洗板5次后加入酶結合物50μl，經溫浴、洗板后加入顯色劑，采用酶標儀比色，若 OD 值≥0.2則為 IgM 抗體陽性，OD 值<0.2則為 IgM 抗體陰性。陽性結果判定標準[7]：結核分枝桿菌 IgG 與 IgM 抗體其中一項為陽性則為 TB-Ab 陽性，否則為陰性。

1.3.4組織培養及病理檢查所有患者給予局部麻醉，在胸部 CT 引導下進行經皮穿刺，采集肺部病灶組織活檢;采用福爾馬林固定活檢樣本，將 NALA 溶解組織與病理組織樣本加入7H9肉湯中，充分碾碎后倒入試管內，加入2% NALC-NaOH 溶液，強力震蕩20 s后，加入50 ml磷酸緩沖液（PBS），以3000 r/min 的速度離心15 min 后，棄去上層液后加入2 ml PBS，接種至培養皿內進行組織培養，培養6周后能分離出結核桿菌者即為陽性，否則為陰性。另外，采用包埋法處理石蠟切片，經光學顯微鏡觀察抗酸桿菌，其中經染色后，細胞質和細胞核為藍色，抗酸桿菌為紅色，若觀察到抗酸桿菌即為陽性。

1.3.5聯合診斷標準 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 兩兩結合檢測與三者聯合檢測均以任一陽性均為陽性為標準[8]。

1.4觀察指標

①比較 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測菌陰肺結核陽性的診斷結果;②比較 TB-IGRA、TB- DNA、TB-Ab 兩兩結合檢測的診斷結果;③比較 TB- IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三者聯合檢測的診斷結果;④比較 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測及聯合檢測的診斷效能：靈敏度、特異度、準確度。

1.5統計學方法

采用 SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析，計數資料以[n （%）]表示，行χ2檢驗，P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab單一檢測結果

經組織培養及病理檢查，158例菌陰肺結核疑似患者中陽性117例，陰性41例;TB-IGRA 檢測肺結核真陽性81例，真陰性31例;TB-DNA 檢測真陽性60例，真陰性36例;TB-Ab 檢測真陽性73例，真陰性30例。見表1。

2.2 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab兩兩結合檢測結果

TB-IGRA + TB-DNA檢測肺結核真陽性91例，真陰性27例;TB-IGRA + TB-Ab檢測真陽性87例，真陰性29例;TB-DNA + TB-Ab 檢測真陽性95例，真陰性28例。見表2。

2.3 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab三者聯合檢測結果

TB-IGRA、TB-DNA 及 TB-Ab 三者聯合檢測肺結核真陽性108例，真陰性25例。見表3。

2.4單一檢測及聯合檢測診斷效能

TB-IGRA 檢測肺結核靈敏度略高于 TB-DNA、 TB-Ab 檢測（ P <0.05）;三者聯合診斷的靈敏度、準確度高于兩兩聯合診斷，而兩兩聯合診斷的靈敏度、準確度高于 TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 單一檢測，差異有統計學意義（ P <0.05）。見表4。

3討論

肺結核是指由結核分枝桿菌引起、發生于肺組織、支氣管、胸膜的結核疾病，傳染性較強、傳播范圍極廣，會嚴重威脅人類健康[9]。控制結核病的關鍵環節在于早發現、早診斷、早治療，提高治愈率，減少肺結核的流行。

細菌學檢查是目前臨床最常用肺結核檢測方法，同時也是確診及治療方案制訂的重要依據[10];但由于肺結核患者痰液呈現間歇性排菌、結核菌自身生長速度較慢或痰標本質量不合格等多種因素影響，使痰分枝桿菌培養結果呈現陰性，導致部分肺結核患者無法確診，增加傳播風險[11]。因此，臨床實踐過程中，應配合有效實驗室檢查完善菌陰肺結核的診斷過程，對病情控制具有重要意義。隨著檢測技術的不斷進步改善，TB-IGRA、TB-DNA、 TB-Ab 等多種更為快捷簡單的檢測在臨床逐漸開展，且本研究中 TB-IGRA 檢測肺結核靈敏度略高于 TB-DNA、TB-Ab 檢測（ P <0.05），與龔清河[12]結果具有一致性。其中 TB-Ab 屬于體液免疫檢查技術，肺結核患者會產生結核桿菌免疫球蛋白， TB-Ab 通過免疫應答機制對機體抗結核免疫反應進行檢測，據此診斷是否伴有結核桿菌的感染[13]。 TB-DNA 檢測作為結核病診斷的新標準，具有較低誤診率，本研究中診斷肺結核特異度高達87.81%，是補充病原學診斷的最佳選擇，但靈敏度僅有51.28%。而 TB-IGRA 屬于細胞免疫檢查技術，肺結核患者機體外周 T 淋巴細胞參與免疫應答，受到特異性抗原激活后，會轉化為效應 T 淋巴細胞，分泌釋放γ-干擾素[14];TB-IGRA 通過微孔條上預包被的 IFN-γ抗體可與樣品中的 IFN-γ結合，再加入酶標試劑進行二次溫育，當樣品中存在 IFN-γ時，將形成“包被抗體-IFN-γ-酶標抗體”復合物，然后形成催化顯色劑反應，據此診斷是否感染結核菌[15]。由于無論是否有結核病癥狀、免疫功能水平等均對 TB-IGRA 法結果影響較小，都能通過檢測效應 T 細胞確定是否伴有結核分枝桿菌的感染，因此 TB-IGRA 法檢測靈敏度略高。多種檢測方法聯合診斷為臨床提高菌陰肺結核陽性檢出率提供了新的研究方向[16]。基于此，本研究將 TB-IGRA、 TB-DNA、TB-Ab 三種方法聯合應用，結果顯示三者聯合診斷靈敏度、準確度均高于單一檢測或兩兩聯合檢測（ P <0.05），其中三者聯合檢測可將單個方法檢測的靈敏度69.23%、51.28%、62.39%提高至92.31%，因此聯合檢測能明顯提高診斷效能，減少菌陰肺結核的漏診誤診，臨床可推廣應用。但本研究取樣以單中心為主，且樣本量較小，具有一定局限性，臨床進一步研究中應擴大樣本量，并盡量多中心取樣，保證研究合理性與準確度;另外，臨床可進一步結合其他診斷方法如結核菌純蛋白衍生物試驗、TST、HLA-G 等進一步提高對肺結核的診斷價值，為臨床提供更加準確的診斷結果，協助臨床治療。

綜上所述， TB-IGRA、TB-DNA、TB-Ab 三種方法聯合檢測能提高菌陰肺結核患者診斷效能，有助于臨床合理治療方案的制訂，具有良好應用價值。

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（收稿日期：2021-06-22）