ALA-光動力療法對人SCC細胞凋亡的影響

喬 麗，李 強,蔡 宏,田 蓉,楊志勇,孫 平，梅竹松，馬紅雨，李 菲*

（1.空軍特色醫學中心皮膚科，北京，100142；2.空軍特色醫學中心臨床醫學實驗室，北京，100142；3.空軍特色醫學中心臨床檢驗科，北京，100142）

皮膚鱗狀細胞癌（skin squamous cell carcinoma）是臨床上常見的皮膚惡性腫瘤之一，是僅次于基底細胞癌、發病率位于第二位的皮膚癌。它好發于頭面部，老年人多見，位于近眼瞼內眥、鼻唇溝、鼻背、口唇等部位。皮膚癌的發病率呈逐年增加的趨勢，嚴重者可以危及生命，近年來引起人們的廣泛重視，及早地診斷和治療，可以減少因該病對機體所造成的危害。以往的主要治療方法是手術、冷凍、激光、藥物等，效果并不理想，而且易造成疼痛、毀容等不良后果。

5-氨基戊酮酸光動力學療法（5-aminolaevulinic acid-based photodynamic therapy，5-ALA-PDT）在近年不斷發展和成熟，由于其美容效果好，患者的接受程度高。目前已成為繼手術、放療、化療、免疫治療等傳統腫瘤治療方法之后的一種新療法。5-ALA-PDT在臨床上已經廣泛于治療皮膚的淺表腫瘤，如皮膚鱗狀細胞癌、基底細胞癌、Bowen氏病等。然而盡管光動力治療腫瘤的方法越來越多的應用于臨床實踐，但其機制尚未完全闡明。本文著重于研究5-ALA-PDT對人SCC細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源

A431細胞獲贈予南京皮膚病研究所。細胞培養于DMEM高糖培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium):4 mM L-谷胺酰胺，100 U/ml 青霉素，0.1 mg/ml streptomycin,1 mM sodium pyruvate,100 mM HEPES)，置于含有5%的C02，37℃的孵育箱中培養。由于細胞系可以在沒有血清的情況下短暫生長,為了避免PpIX快速釋放到培養基中,血清不會被添加到DMEM中[1]。

1.1.2 PDT 處理參數

采用波長為630nm的半導體激光進行照射,調整功率密度為10mW／cm2照射時間分別為125s、250s、500s，即能量密度分別為 1.25，2.5、5J/cm2[總光照計量 (J/cm2)=功率密度(W/cm2) ×照射時間(s)]。

1.2 方法

1.2.1 A431細胞的傳代培養

用胰酶消化1-2min后,置于顯微鏡下觀察細胞是否變圓并且逐漸從培養皿中脫落，當細胞變圓且完全脫落呈游離狀態時終止消化。收集消化液，用1500pm離心3min后收集細胞沉淀。用適當體積、配置好的培養基懸浮細胞，并分別用裝到槍頭轉移到新的培養皿中。最后將培養皿置于細胞培養箱中，每天在顯微鏡下觀察細胞的生長情況,隔日換液。

1.2.2 流式細胞技術（FCM）檢測活性Caspase-3的表達

PDT處理和實驗分組:將實驗分為對照組和5-ALAPDT組,其中5-ALA-PDT組：加入濃度為0.4 mg/ml ALA 后避光孵育 4h后照光,照射強度為 2.5 J/cm2 (10 mW/cm2，250s),然后繼續將細胞放回孵箱中孵育20h,再進行下一步實驗檢測。其中對照組不給予光敏劑和照光處理。

收集各組細胞，離心后用PBS洗滌各組細胞2次，再次離心后用Binding Buffer制成總數約為 1×105細胞/毫升的重懸液。用Cytofix／CytopermTM（美國BD公司）破細胞膜后加入Caspase3mAb(1：50),室溫下避光孵育2小時;用PBS洗滌三遍后加入用FITC標記的二抗(1：100),室溫下避光孵育30min后上機進行檢測分析。

1.2.3 免疫熒光檢測法

PDT處理和實驗分組:將實驗分為對照組和5-ALAPDT組,其中5-ALA-PDT組：加入濃度為0.4 mg/ml ALA 后避光孵育 4h后照光,照射強度為2.5J/cm2(10 mW/cm2，250s),然后繼續將細胞放回孵箱中孵育20h,再進行下一步實驗檢測。其中對照組不給予光敏劑和照光處理。

收集各組細胞,離心后用PBS洗滌各組細胞2 次,在4%濃度的多聚甲醛中放置15min。用0.1%濃度的Triton x–100將細胞透性化 4min。再用PBS沖洗之后,將細胞與有活性的Caspase-3單克隆抗體(以1:100的比例稀釋在PBS中) 在4°C的環境中在一起放置12小時。之后A431細胞將在與FITC-綴合山羊鼠抗免疫球蛋白(以1:100比例稀釋在PBS中)作為第二抗體的環境中培養30min,并且在顯微鏡下觀察前加入PI(150mmol/L)。

2 結果

2.1 5-ALA-PDT 作用對活化的Caspase-3 亞細胞定位的影響

Caspase-3被認為是哺乳動物細胞凋亡通路中的重要蛋白質。Caspase-3的前體形式存在細胞質中,但在凋亡誘導后可從細胞質轉移到細胞核,并在細胞核中發揮重要作用[72，73，74]。我們研究發現在PDT處理前Caspase-3主要存在于細胞質中,而在PDT處理后細胞凋亡時Caspase-3主要存在細胞核中(圖2-1)。這些結果表明,在ALA-PDT治療后,A431細胞中Caspase-3活化從細胞質轉移到細胞核。

2.2 5-ALA-PDT可通過激活Caspase-3誘導A431細胞凋亡

為了進一步研究ALA-PDT誘導A431細胞凋亡中是否存在Caspase-3的激活。我們發現活化的Caspase-3的表達水平在ALA-PDT作用A431細胞12小時后顯著增加(與對照組比較，*p＜0.05，圖2-2)。

圖1 ALA-PDT治療對具有活性的Caspase-3亞細胞定位的影響。PDT處理后收集細胞，固定后用FITC和propidiu碘染色后在熒光顯微鏡下觀察。（在光動力療法(PDT)治療后，在A431細胞(A)中具有活性的CaspaseCaspase-3-FITC細胞顯示綠色熒光(A)。）Bar=50μM

圖2 活化的Caspase-3在5-ALA組、激光組和5-ALA-PDT組中表達的變化。*，p <0.05 vs對照組。采用流式細胞術檢測ALA、激光和5-ALA-PDT處理后活化的Caspase-3的變化。

3 討 論

細胞凋亡（apoptosis）是指在多種體內外因素的誘導下，由細胞內基因精密調控而發生的細胞自殺的過程,因此凋亡又被稱為程序性細胞死亡（programmd cell death.PCD）。與細胞壞死不同，細胞凋亡是一個由基因控制的、細胞主動發生的、高度有序的細胞學現象。細胞凋亡是最常用的細胞死亡機制,也是每一個細胞必經之道。不僅在多細胞生物生命期的每個時期,細胞凋亡都是組織動力學的基本機制甚至有一些單細胞個體也會出現或多或少的細胞凋亡特征。在大多數情況下細胞凋亡由來自細胞外的細胞凋亡誘導因素誘導激活細胞凋亡信號,并通過信號轉導通路最終激活細胞凋亡的程序,導致細胞凋亡。目前，細胞凋亡的信號傳導大體分為兩條基本途徑：(1)外源性途徑，由TNF-a，TRAIL，FAS-L等死亡受體介導;死亡受體通路是重要的外源性凋亡通路。其主要通過死亡受體與細胞膜表面相應配體的結合,形成了死亡誘導信號的復合體,從而激活天冬氨酸蛋白水解酶8(Caspase-8），誘導機體產生兩種細胞凋亡的途徑，一種途徑是直接激活其下游的Caspase-3和Caspase-7，從而誘導細胞凋亡，此途徑不需要線粒體的參與;另一種途徑是依賴于Caspase-8催化了水解線粒體蛋白，從而引起線粒體損傷，開啟了其損傷參與線粒體通路介導的凋亡[2-4]。(2)內源性途徑,由于線粒體外膜通透性增加所介導。它包括線粒體途徑和內質網途徑,一些凋亡刺激因素如化療藥物、射線等可以導致線粒體膜的通透性轉換孔（permeability transition pore，PTP）打開或發生其它變化,進而促使線粒體釋放凋亡啟動因子。線粒體在射線照射，藥物刺激或DNA損傷等條件下,釋放cyto c 等因子至胞漿,cyto c與apaf1及Caspase 9 形成復合體,從而自激活Caspase 9,活化的Caspase 9切割活化下游Caspase 如Caspase3和Caspase7，從而執行凋亡[5]。Cyto c 的釋放還可以由Caspase 8的活化引起,活化的Caspase 8切割bid，bid的截短體進入線粒體,促進cyto c的釋放,進而引發下游反應。這些刺激因素同時還可以使未折疊蛋白發生聚集,導致內質網應激反應的發生,最后通過多種方式引起細胞的凋亡[6]。

我們研究發現在5-ALA-PDT在誘導A431細胞凋亡的過程中,可以使具有活性的Caspase-3轉移進入細胞核，從而誘導細胞凋亡[7-8]。