自體脂肪移植技術的研究進展

邵倩倩，呂大倫

（皖南醫學院第一附屬醫院弋磯山醫院燒傷整形外科，安徽 蕪湖，241001）

各種原因引起的軟組織缺損或發育不全一直是整形外科醫生關注的主要問題之一。近年來，由于自體脂肪移植在軟組織填充中的應用及其對局部組織再生作用的不斷發展，使得該技術在整形外科領域得到廣泛接受和使用。目前經常報道的美容應用包括乳房、臀部、面部和手部的軟組織增強，足底脂肪墊的改善、各種創傷后和手術后輪廓畸形的矯正以及改善增生性瘢痕組織、放射后后遺癥、脂肪營養不良、色素沉著、衰老皮膚變化和光化性損害方面的應用等[1]。然而，研究顯示移植后脂肪組織吸收率在20%～80%之間，可見移植后脂肪組織低存活率的問題仍然是目前困擾該技術發展的難題[2]。脂肪組織顆粒大小、脂肪細胞物理損傷、脂肪細胞缺氧時間、脂肪組織中脂肪干細胞的數量和受體微環境等都是影響脂肪移植的可調節因素。大量文獻表明通過優化脂肪組織獲取技術、移植前準備程序和移植后護理以及脂肪組織工程等，有望增加移植脂肪的體積保留率，改善移植效果。本文就自體脂肪移植技術的研究進展進行綜述。

1 脂肪移植的科學基礎

早在20世紀50年代Peer[3]等人就進行了體內脂肪移植的實驗研究，這是研究脂肪細胞移植后如何存活的最早科學方法之一。他的細胞存活理論被廣泛接受，并在接下來的幾十年里指導了脂肪移植研究的方向。此理論認為脂肪移植物中的脂肪細胞在收獲和加工后必須保持其活性，脂肪細胞獲取時損傷程度越小，移植后脂肪存活率就越高。Carpaneda和 Ribeiro[4]在他們的研究中進一步證明，自體脂肪移植后在血管化組織2mm內的脂肪細胞可以通過胞漿吞噬和早期血運重建機制存活下來。這提示臨床醫生以及相關研究者們在注射脂肪移植物時，應每次少量，還應該在多層次多通道注射，通過增加移植脂肪組織與周圍受體組織的接觸面積來提高其成活率。此外，Zhao[5]等人進行了動物實驗研究，他們證明了脂肪細胞在移植后可以直接存活，且隨著時間推移受體部位會有新生血管生成。這些報道進一步支持了細胞存活理論。然而，該理論本身并不能解釋臨床上觀察到的所有脂肪移植現象。隨著最近的研究開始表明，移植物替代理論的接受度越來越高，即激活脂肪干細胞（Adiposederived stem cells，ADSCs）來替代退化的脂肪細胞。來自日本的Yoshimura[6]等人是移植物替代理論的主要支持者之一。他們專注于脂肪移植中各種細胞的作用，通過建立動物模型，來研究不同類型細胞在不同缺血條件下的命運。結果證明在重度缺血條件下，隨著時間推移，所有的細胞都會退化。在輕度和中度缺血時，脂肪細胞容易死亡，而脂肪干細胞/前體細胞在缺血條件下能夠存活下來，并被激活以進行脂肪組織的修復和替換。在他們隨后的研究中，同一作者小組展示了移植后組織動態重塑的強有力證據[6]。他們觀察到，移植的脂肪可以分為三個不同的區域，從外圍到中心，存活區域(邊緣組織300μm以內)，再生區和壞死區。這些區域對應前面描述的輕度、中度和重度缺血情況。在存活區和再生區，脂肪前體細胞經歷活化和分化為新的脂肪細胞。從本質上講，移植物替代理論指出，幾乎所有的脂肪細胞，除了周圍300μm內的脂肪細胞，在移植后的頭幾天內都會發生壞死。活化的ADSCs促進血管生成，而死亡的脂肪細胞形成脂滴，并被巨噬細胞吞噬吸收。一些死亡的脂肪細胞被來自前體細胞的新脂肪細胞取代。脂肪移植物保留的最終體積由祖細胞成功替代脂肪細胞的百分比決定。移植物存活理論部分解釋了游離自體脂肪移植后移植物存活的機制，這使得臨床關注的焦點是在移植過程中維持脂肪細胞的活性。而移植物替代理論用現代組織學和免疫組織化學染色技術表明，缺血區內的部分脂肪細胞發生壞死和變性，但這些缺血區也存在ADSCs的激活，ADSCs的激活導致新的脂肪細胞生成，這就構成了最終的脂肪存活量。總之，這兩種理論都可能在最終的脂肪移植存活中發揮作用，而且每種理論在不同的患者身上都可能發揮更關鍵的作用。作為研究者深入了解脂肪組織移植的潛在機制，將有助于制定更好的策略，以改善脂肪移植后的臨床結果。

2 脂肪組織的獲取方式

脂肪收獲的技術和方法有很多種，但對于哪種方法或技術能提供更多有活力和功能性的脂肪細胞，仍然存在很大的爭議。脂肪移植物基本可劃分為脂肪組織塊、顆粒脂肪(包括納米脂肪)、基質血管組分等。不管是團塊脂肪、顆粒脂肪(納米脂肪)還是基質血管組分的移植，保持脂肪組織結構的完整性才是最重要的。在目前的臨床實踐中，脂肪收獲的方法主要有切割法和吸脂法，其中吸脂法包括真空輔助吸脂術和注射器吸脂術。目前國際公認的自體脂肪移植技術是科爾曼技術，該技術是將10毫升注射器與直徑為3毫米的鈍性針頭連接以獲得脂肪移植物的方法。與其他方法相比此方法對脂肪組織的損傷更小，在移植后脂肪存活率相對更高。并且已有相關研究證明，通過這種技術可以獲得更多完整的和高酶活性(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的脂肪細胞，從而確保了移植脂肪細胞的存活[7]。Fan等人[8]使用直徑為5mm的鈍頭套管和較大的側孔(每孔直徑約30mm)獲得巨脂肪。隨后，利用新發明的體外切割裝置，將大脂肪切成微脂肪，命名為脂肪源性祖細胞富集脂肪(AER脂肪)，移植到裸鼠體內，結果顯示AER脂肪含有更多的DPP4 +祖細胞并且具有更好的組織學結構和更高的毛細密度，移植后移植物的保留率明顯高于科爾曼法組。

3 脂肪組織的基本處理技術

提高脂肪移植成活率的重要前是確保移植組織中脂肪細胞的活性，以及保持較高濃度的基質血管部分細胞和脂肪干細胞。在脂肪移植過程中應該優化脂肪組織收獲后的處理方法以增加活性較高的基質血管部分細胞和脂肪干細胞的數量。目前，脂肪組織收獲后的各種脂肪加工技術主要包括靜置、離心、棉紗卷繞以及洗滌和過濾系統[9]。靜置法是使用最早且最簡單的脂肪移植物處理方法，其優點是不需要對移植物進行額外處理，不會造成脂肪組織的損耗，但是實際操作耗時較長，效率低，且對脂肪組織純化不夠徹底。部分學者認為，通過離心法獲得的脂肪顆粒含有更少的雜質成分，但不同的離心速度會影響脂肪細胞的完整性[10]。多份報告顯示，超過3000轉/分(1200克)的離心力可能會導致更大程度的細胞損傷[11]。另外有研究表明，與離心、過濾和洗滌相比，棉紗布處理過的移植組織物保留了更多的完整細胞和高活性的脂肪組織[12]。簡而言之，目前還沒有一種技術能顯示出比其他技術更好的脂肪移植效果。

4 脂肪組織移植前的輔助處理

脂肪移植后，移植組織內部需要盡早建立新的血供，避免因供血不足、缺氧、代謝產物堆積等造成的移植組織損害。如果受區供血不足，尤其是中央區移植組織不能及時得到血流灌注，將嚴重影響移植脂肪的成活率[13]。因此，對于改善脂肪細胞的成活率，加速移植后血供重建，改善移植組織血流灌注是十分必要的。為此，眾多研究者紛紛進行了各種嘗試，如移植前在移植脂肪組織中加入各種功能細胞、生長因子、干細胞以及藥物等，來努力改善移植區的微環境，以期提高脂肪在受區的成活率。本文主要介紹幾種常見的移植前輔助處理方法具體如下：

4.1 富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)和富血小板纖維蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)

PRP中的生長因子可以促進移植脂肪組織中新生血管的形成，從而改善脂肪移植相關的缺血恢復[14]。有關研究也證明了PRP可以在體外提高脂肪細胞的存活率，促進脂肪干細胞增殖和分化[15]。此外，Yu[16]等人通過裸鼠實驗模型證明了PRF可促進移植脂肪的自分泌功能，使其產生更多的生長因子。他們認為PRF可能通過促進血管重建和干細胞成脂化發生以及抑制細胞凋亡和調節膠原蛋白的產生，來提高了移植脂肪的保留率。他們還認為PRF在提高脂肪移植物存活率方面可能比PRP更好。而Grant[17]等人不同意這個觀點，他們認為這是由于PRF在更長的時間內(14-20天)釋放促血管生成生長因子的原因。并且認為在移植后24小時窗口期之后長時間注射生長因子對不能存活的脂肪細胞沒有任何作用。到目前為止，只有1項研究[18]直接比較PRF和PRP，研究結果表明二者無明顯差異，當然這不排除有可能是由于該項研究不足以(n=20)識別微小的差異。然而，PRP釋放的生長因子半衰期較短，且在注射脂肪組織中分布不均，因此PRP在脂肪移植中的應用策略需要進一步完善。Li等人[19]基于移植后1周毛細血管開始長入脂肪移植物，2周達到高峰的特性，推測移植物內部延遲兩步注射PRP，理論上可能會有利于移植脂肪組織內的微血管生長。因此他們利用裸鼠模型證明了新的延遲兩步注射PRP策略可以顯著提高脂肪的長期存留率，并改善脂肪移植物內部的新生血管植入程度。另外，研究顯示PRP中不同的血小板濃度會導致不同濃度的生長因子和不同的治療效果，PRP中生長因子的持續釋放以及適宜的濃度都對治療效果有著重要影響[20]。因此，PRP的制備和治療方法還需要進一步規范和完善。

4.2 血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF是促血管生成因子家族中的重要一員，其中的可溶性分泌型蛋白能直接誘導血管內皮細胞增殖，促進組織血管再生，并增加血管通透性。研究表明VEGF基因轉染的人脂肪干細胞可以提高自體脂肪移植的存活率。Zhang 等人[21]通過裸鼠模型評價VEGF轉染的人脂肪干細胞條件培養液(VEGFADSCs-CM)在脂肪移植中的作用。結果表明，VEGFADSCs-CM組的存活率最高，脂肪細胞形態最好，VEGF分泌水平也最高。因此，他們認為VEGFADSCs-CM作為脂肪移植的有效輔助手段能有效提高脂肪移植的存活率。Yu等人[22]在脂肪移植模型中研究表明，編碼血管內皮生長因子的修飾mRNA（VEGFmodified mRNA，modVEGF）工程設計的人類脂肪來源的干細胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）可以改善脂肪細胞脂肪的存活率，尤其是在長期移植后階段。移植后第15、30和90天收集的脂肪移植物的詳細組織學分析表明，從modVEGF工程化的hADSC中釋放VEGF蛋白可顯著改善新血管生成、血管成熟和細胞增殖。與對照組相比，modVEGF工程化的hADSCs還可以顯著減輕移植脂肪組織纖維化、凋亡和壞死的存在。

4.3 脂肪來源干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)和細胞輔助脂肪移植（Cell-assisted lipotransfer，CAL）技術

ADSCs具有許多生物特性，且具有分化為脂肪胞、肌細胞、骨細胞、軟骨細胞和內皮細胞等多種細胞類型的能力，有助于脂肪移植物的保留[23]。有研究發現ADSCs可以通過促進移植物內部血管生長因子表達，進而促進移植物內部血管化生成，以此來提高脂肪移植物保留率[24]。同時有研究發現，ADSCs不僅能在低氧條件下存活，而且能夠加快移植后缺血的恢復，減少因低氧應激而死亡的細胞數量，從而改善移植物體積保留[25]。除此之外，ADSCs還可以通過旁分泌作用分泌各種生長因子，在抗凋亡、抗炎、血管生成和免疫調節中起重要作用[26]。目前，除了添加ADSCs外，研究者們還嘗試在移植物中加入其他輔助細胞，如間質血管成分細胞、臍帶間充質干細胞、骨髓干細胞等，稱為細胞輔助脂肪移植技術，以期改善脂肪移植物的保留率。CAL的優勢只有在注射小脂肪體積時才顯得顯著[27]。Zhou[28]等人的研究表明，與傳統的脂肪移植相比，細胞輔助脂肪移植的效果更令人滿意，然而它更適用于面部移植，而不是乳房移植。總之，到目前為止還沒有足夠的證據表明細胞輔助脂肪移植在減少并發癥方面優于傳統的脂肪移植。

4.4 基質血管成分（Stromal vascular fraction，SVF)

SVF勻漿包含多種活性細胞，主要包括脂肪來源的干細胞(ADSCs)、內皮細胞、內皮祖細胞、周細胞、成纖維細胞和免疫細胞等[29]。Zhu等人[30]利用小鼠實驗證實，SVF通過促血管生成機制（旁分泌功能和參與新血管的形成）以及SVF的抗炎特性（各種細胞因子的表達和抑制以及巨噬細胞表型的轉化）提高了脂肪移植后移植物的保留率。Yin等人[31]通過臨床試驗證明了自體SVF輔助脂肪移植不僅可以改善移植物的存活率，在改善面部皮膚質量方面的也有明顯效果。研究表明SVF與VEGF、血管緊張素轉換酶-1(Ang-1)等血管生成因子聯合應用可促進血管生成。然而，由于血管生成因子的半衰期較短，直接使用這種混合物進行移植是不夠的。He等人[32]通過實驗評價了VEGF/Ang-1-PLGA(聚(乳酸-乙醇酸)共聚物)微球加SVF雙緩釋系統能否改善自體脂肪移植后的血管生成和移植物存活。結果表明，SVF聯合VEGF/Ang-1-PLGA緩釋微球可以改善自體脂肪移植后的血管生成和移植物存活。

4.5 A型肉毒毒素（Botulinum toxin A，BTX-A）

研究發現在脂肪移植中A型肉毒毒素可通過促進細胞增殖、脂肪生成和血管生成來改善脂肪組織的植入效果[33]。Nian[34]等人在利用大鼠模型實驗證明去神經支配改善移植脂肪在肌肉中的存留率，他們認為肌肉的固定可以提高肌肉內注射的脂肪的保留率，這可能是因為固定化可以防止剪切力對新生血管的損傷，提高新生血管密度和ADSCs的密度。基于BTX-A固定肌肉的這一特性，他們做了另一項實驗，即將經過BTX-A處理的脂肪移植物移植到大鼠身上，發現移植物保留率增加，細胞完整性得到保護，血管擴張和內皮細胞增殖得到增強。然后，他們用BTX-A培養ADSCs，發現BTX-A可以提高ADSCs的增殖、成脂化和血管生成能力。因此證明了BTX-A可提高移植脂肪在肌肉中的存留率、血管密度和成熟脂肪細胞密度，改善移植脂肪的組織學特性[35]。

4.6 去鐵胺（Deferoxamine，DFO)

DFO是一種螯合劑，臨床常用于治療鐵中毒和血色素沉著癥。它能增加缺氧誘導因子-1α基因在細胞中的表達，并通過隔離鐵來穩定缺氧誘導因子-1α，這是降解缺氧誘導因子-1α所必需的輔因子。因此DFO可以作為模擬缺氧的藥物來誘導缺氧促進血管生成[36]。有研究發現DFO可增加大鼠脂肪移植物的存活率，并且可能是自體脂肪移植中有效的添加成分，其可增加脂肪移植物的生存力并獲得持久穩定的移植效果[37]。有學者通過實驗證明用DFO預處理可以增強放射治療后脂肪移植軟組織重建的效果[38]。Kim等人[39]利用大鼠模型實驗證明自體脂肪移植中受體部位用DFO預處理可通過誘導VEGF表達和新生血管來增加脂肪移植物的存活率。

4.7 其他藥物以及處理技術

相關研究指出，在脂肪移植物中加入胰島素及胰島素樣生長因子[40]、堿性成纖維細胞生長因子[41]、白細胞介素-8[42]、選擇性β1受體阻斷劑[43]、胸腺素β4[44]等藥物以及經過促紅細胞生成素[45]、米諾環素[46]、透明質酸酶[47]、三苯氧胺[48]預處理都能不同程度的改善脂肪移植后的存活率，但移植后總體效果欠佳。Zhou等人[49]研究發現中藥川芎嗪可提高脂肪干細胞移植存活率。該機制可能是其通過誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ、CCAAT/增強子結合蛋白α、Alu等與脂肪形成相關的轉錄因子的表達，從而促進脂肪細胞的生長。此外，有研究發現移植前對受體部位進行缺血缺氧預處理等也可以提高脂肪移植存活率[25]，但此方法的臨床應用效果以及弊端還有待觀察研究。

5 脂肪組織工程

近幾年，隨著組織工程學及再生醫學的發展，為解決脂肪移植過程中低存活率的難題帶來了新的解決思路。脂肪組織工程的構建需要選擇合適的種子細胞、支架材料，以及適宜的微環境。目前脂肪組織工程常用的種子細胞有脂肪干細胞、骨髓間充質干細胞等[50]。脫細胞真皮基質(Acellular dermal matrix，ADM)是目前組織工程中常用的支架材料，已被廣泛應用于腹壁和乳房再造，以及與自體移植皮膚結合用于創面修復等[51]。Lee[52]等人發現，從人脂肪組織中獲得的脂肪干細胞與微粒化脫細胞真皮基質共培養，植入體內后觀察發現有脂肪組織再生。Zhu 等[53]將體外預處理過的ADSCs與激光打孔的異種(豬)脫細胞真皮基質（Porcine acellular dermal matrix，PADM）復合，在體內構建真皮－脂肪復合組織，結果發現僅復合物周邊區域可見少量的炎癥細胞，脂肪組織及微孔內均可見新生血管長入，提示了經過體外預處理的PADM植入體內后可獲得充分的血供。另外有研究將PADM-脂肪顆粒混合物注入裸鼠體內，結果發現添加PADM顯著降低了脂肪液化、促進了脂肪組織再生并提高了再生組織中CD34的水平。并且該實驗提示PADM可通過增加巨噬細胞浸潤、細胞外基質再生和血管重建來減少脂肪液化，從而提高了脂肪存活率[54]。

6 脂肪組織移植后的處理

脂肪移植術后，一般不需要使用抗生素。YU等人[55]在兔模型中發現脂肪移植術后注射丹參能促進脂肪組織移植血管的新生，顯著提高自體移植脂肪組織的存活率。Zheng等人[56]也研究發現丹參具有提高隆胸手術脂肪保留率的潛力。由于移植物直到3個月后脂肪生成完成后才穩定下來，因此長期隨訪對于全面評估脂肪移植手術后的結果是至關重要的[57]。

7 展 望

隨著自體脂肪組織作為軟組織填充材料在臨床中的廣泛應用，提高脂肪移植的成活率成了許多學者的研究目標。雖然目前在脂肪移植物收獲、移植物準備和移植物注射過程等方面的技術都有了不同程度的提高和改善。但由于設備和操作技巧的限制，這些方案很難標準化。添加各種生長因子以及藥物促進脂肪組織再生是一種有效的方法。然而，對藥物從研發到應用的安全性進行充分評價通常需要很長的時間，成本也非常高。使用干細胞作為添加劑也是提高脂肪存活率的有效方法。然而，干細胞的臨床應用仍然受到法律以及倫理的限制。近幾年，隨著組織工程學及再生醫學的發展，也為脂肪移植成活率的改善帶來了新的靈感，然而目前相關研究以及技術還不成熟，如何同時發揮二者的優勢，成為目前眾多學者共同探索的目標。添加商品化生物材料混合移植技術，目前還在實驗階段，需要臨床驗證和長期觀察來評估其安全性和有效性。因此，綜合本文研究內容來看，目前尚且沒有單一有效的方法能夠保證脂肪移植的成活率。相信隨著研究者對自體脂肪移植相關技術的不斷深入認識，必將制定更好的策略來改善脂肪移植后的體積保留率以及臨床效果，從而使其優越性得到充分發揮以及在臨床中得到更廣泛應用。