丹參多酚酸鹽通過抑制內質網應激減輕小腸缺血再灌注損傷的研究*

李貴賓

（冀中能源峰峰集團有限公司總醫院邯鄲院區外科，邯鄲 056002）

腸缺血再灌注（I/R）損傷是臨床上常見的并發癥，多見于腸道手術、重度感染、休克、心功能不全等疾病，是導致腸內毒素、細菌進入血液循環，刺激炎癥介質、趨化因子等大量釋放，進而引發多器官功能障礙綜合征[1-2]。病理學研究發現，炎癥反應及繼發性細胞凋亡是腸I/R損傷發生發展的重要機制[3-4]。

丹參多酚酸（SAL）是中藥丹參的主要活性成分，包括丹參酚酸A、丹參酚酸B、丹參素、原兒茶醛等，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學活性[5-6]，目前臨床上主要用于缺血性心血管疾病的治療。近年來研究發現，丹參酚酸A能夠通過抑制細胞凋亡，丹參酚酸B能夠通過抑制炎癥反應減輕I/R損傷[7-8]。內質網應激是機體調節炎癥反應和細胞凋亡的重要通路[9-10]，本研究將復制小腸I/R損傷大鼠模型并于造模前給予SAL進行預處置，研究SAL對小腸I/R后內質網應激的影響，進一步探討SAL對小腸I/R損傷的保護作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠144只，7周齡，體質量（220±20）g，購自河北醫科大學實驗動物中心[SYXK（冀）2018-004]，實驗前適應性飼養7 d。光照黑暗 12 h∶12 h 交替、溫度（25±1）℃、相對濕度（60±5）%。實驗前12 h禁食禁水。

1.2 藥物與試劑 注射用丹參多酚酸鹽（SAL，規格50mg/瓶）購自上海綠谷制藥有限公司（批號190527）；銀杏葉提取物注射液（EGB，規格 5 mL∶17.5 mg）購自悅康藥業集團有限公司；C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒和原位末端轉移酶標記（TUNEL）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；糖調節蛋白78（GRP78）、c-Jun 氨基端激酶（p-JNK）、增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）、核因子-κB（NF-κB）、激活型半胱氨酸蛋白酶-3（Cleved Caspase-3）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）試劑盒、增強化學發光（ELC）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 動物分組、給藥與模型制備 將144只實驗用Wistar大鼠進行數字編碼，按照隨機數字表法分為假手術組（Sham 組），I/R 組，SAL低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組[11]和 EGB 組（陽性對照組，3.15 mg/kg）[12]，每組24只。各組于造模前30 min腹腔注射給藥進行預處置，Sham組和I/R組給予生理鹽水。除Sham組外，其余各組大鼠均參照武向鵬等[13]報道的方法，通過手術分離并夾閉腸系膜上動脈60 min的方法復制小腸I/R損傷大鼠模型。再灌注120 min后行各指標檢測。

1.4 腸組織含水量的測定 各組隨機取8只大鼠，麻醉后開腹取回盲部10 cm以上部位的腸管，用生理鹽水將腸內容物和血液沖洗干凈、濾紙拭干后稱質量為濕質量（W1），置95℃烤箱烘烤至恒質量后稱質量為干質量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.5 腸組織病理學檢查與細胞凋亡觀察 各組隨機取8只大鼠，麻醉后開腹取回盲部10 cm以上部位的腸管，用生理鹽水將腸內容物和血液沖洗干凈后置4%多聚甲醛溶液固定72 h后，液體石蠟浸潤包埋、5 μm厚度連續切片，經二甲苯透明和梯度乙醇脫水處理后。1）行常規HE染色，封片后通過光學顯微鏡腸組織病理學變化；采用Chiu’s氏評分標準進行損傷評分：未見異常計0分，腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬計1分，絨毛尖端上皮抬高與固有層剝離計2分，絨毛兩側上皮成塊脫落計3分，上皮完全脫落計4分，黏膜固有層崩解并出血計5分。2）遵照TUNEL試劑盒操作說明行染色處理，50%甘油封片后通過光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況（細胞核黃褐色為陽性著色）；凋亡指數（AI）的計算：分別計數視野中總細胞數和陽性細胞數，AI（%）=（陽性細胞數/總細胞數）×100%。

1.6 腸組織炎癥因子水平檢測 取各組剩余的8只大鼠，麻醉后開腹取回盲部10 cm以上部位的腸管，用4℃預冷生理鹽水將腸內容物和血液沖洗干凈后，剪碎、加入9倍量4℃預冷裂解液、研磨勻漿，3 000 r/min，離心半徑 10 cm，離心 10 min，取上清液，然后遵照ELISA試劑盒操作說明處理，通過酶標儀檢測腸組織CRP、TNF-α、IL-1β水平。

1.7 腸組織蛋白表達檢測 取腸組織勻漿液，4℃、12 000 r/min，離心半徑8 cm，離心20 min取上清液，檢測總蛋白含量后通過95℃水浴使蛋白變性，30 μg蛋白量上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、麗春紅染色、5%脫脂奶粉溶液37℃封閉60 min，磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液）洗膜3次后滴加目標蛋白抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，PBS溶液洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育1 h，PBS溶液洗膜后滴加ELC發光試劑顯色，以β-actin為內參，通過凝膠成像系統半定量目標蛋白表達量。

1.8 統計學方法 運用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織含水量的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠腸組織含水量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL中、高劑量組和GBE組含水量降低，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；SAL高劑量組含水量與EGB組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織病變及Chiu’s氏評分的影響 Sham組大鼠腸組織未見病理性形態結構改變；I/R組可見腸系膜組織結構紊亂、上皮細胞脫落、固有層分離、大量炎性細胞浸潤等病變；與I/R組比較，SAL低、中、高劑量組和EGB組上述病變呈不同程度減輕，其中SAL高劑量組腸系膜結構較完整、炎性細胞明顯減少，效果優于其他組。計算Chiu’s氏評分：與Sham組比較，I/R組大鼠Chiu’s氏評分顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL中、高劑量組和EGB組Chiu’s氏評分顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與EGB組比較，SAL高劑量組Chiu’s氏評分顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表1。

圖1 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織病變的影響（HE，×200）Fig.1 The effect of SAL on the pathological changes of intestinal tissue in rats with small intestinal I/R injury(HE，×200)

2.3 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸細胞凋亡及AI的影響 Sham組大鼠腸組織可見極少量的凋亡細胞；模型組凋亡細胞數量明顯增多，AI較Sham組顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL中、高劑量組和EGB組凋亡細胞數量明顯減少，AI較I/R組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與EGB組比較，SAL高劑量組AI顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

表1 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織含水量、Chiu’s氏評分和 AI的影響（±s）Tab.1 The effect of SAL on intestinal tissue water content，Chiu’s score and AI in rats with small bowel I/R injury（±s）

表1 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織含水量、Chiu’s氏評分和 AI的影響（±s）Tab.1 The effect of SAL on intestinal tissue water content，Chiu’s score and AI in rats with small bowel I/R injury（±s）

注：與 Sham 組比較，*P<0.01；與 I/R 組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 EGB 組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別S h a m組I/R組S A L低劑量組S A L中劑量組S A L高劑量組E G B組動物數含水量（%） C h i u’s氏評分（分）A I（%）8 8 8 8 8 8 7 3.0 1±3.8 3 0.3 6±0.1 3 3.3 8±0.6 5 8 4.6 7±5.9 4* 3.7 4±0.5 2* 4 3.7 2±6.1 8*8 2.5 0±6.1 1 3.6 0±0.5 7 3 8.1 4±5.9 0 7 7.8 6±4.8 5# 2.8 1±0.4 6## 2 3.5 8±4.0 2##7 4.9 4±4.1 7## 1.6 5±0.2 8##△ 1 4.1 3±2.7 5##△△7 6.2 8±4.5 3## 2.0 3±0.3 5## 1 8.6 4±2.9 9##

2.4 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織炎癥因子水平的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠腸組織炎癥因子CRP、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL中、高劑量組和EGB組CRP、TNF-α、IL-1β水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）；與EGB組比較，SAL高劑量組CRP、TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表2。

表2 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織炎癥因子水平的影響（±s）Tab.2 The effect of SAL on the levels of inflammatory factors in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表2 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織炎癥因子水平的影響（±s）Tab.2 The effect of SAL on the levels of inflammatory factors in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.01；與I/R組比較，##P<0.01；與EGB組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別S h a m組I/R組S A L低劑量組S A L中劑量組S A L高劑量組E G B組動物數8 8 8 8 8 8 C R P（m g/g） T N F-α（n g/g） I L-1 β（n g/g）4 1.6 4±5.0 8 1 1.3 7±1.6 5 4 3.6 7±5.2 9 1 8 5.6 3±3 1.4 9* 4 3.0 5±7.2 8* 9 2.1 4±1 5.6 2*1 6 2.4 7±2 8.3 6 3 7.1 8±7.0 3 8 5.0 6±1 4.3 4 1 3 5.8 1±2 2.4 5## 2 8.4 4±5.1 9## 6 9.2 8±1 1.5 0##9 3.6 8±1 6.7 5##△△ 1 9.6 4±3.2 6##△ 5 7.4 1±8.3 7##1 2 4.7 3±2 0.8 6## 2 4.8 6±3.9 4## 6 3.5 9±9.4 2##

2.5 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP蛋白表達的影響 與Sham組比較，I/R組大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP表達顯著上調，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL低、中、高劑量組和 EGB 組 GRP78、p-JNK、CHOP表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.01）；與EGB組比較，SAL高劑量組GRP78、CHOP表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見圖2、表3。

表3 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP 蛋白表達的影響（±s）Tab.3 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表3 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP 蛋白表達的影響（±s）Tab.3 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：與Sham組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與EGB組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別S h a m組I/R組S A L低劑量組S A L中劑量組S A L高劑量組E G B組動物數8 8 8 8 8 8 G R P 7 8/β-a c t i n p-J N K/β-a c t i n C H O P/β-a c t i n 0.1 9±0.0 6 0.1 3±0.0 4 0.2 1±0.0 6 0.9 4±0.1 5* 1.0 5±0.1 9* 1.0 1±0.1 6*0.5 3±0.1 7# 0.9 7±0.1 6 0.7 6±0.1 3#0.4 4±0.1 3# 0.4 8±0.0 9# 0.5 8±0.1 0#0.3 1±0.1 1#△ 0.1 5±0.0 5# 0.4 3±0.0 8#△△0.4 9±0.1 5# 0.1 9±0.0 6# 0.6 1±0.1 2#

圖2 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP蛋白表達的影響Fig.2 The effect of SAL on the expression of GRP78，p-JNK，CHOP protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury

2.6 SAL對小腸 I/R損傷大鼠腸組織 NF-κB、Cleved Caspase-3蛋白表達的影響 與Sham組比較，I/R 組大鼠腸組織 NF-κB、Cleved Caspase-3表達顯著上調，差異有統計學意義（P<0.01）；與I/R組比較，SAL中、高劑量組和EGB組NF-κB、Cleved Caspase-3表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；與EGB組比較，SAL高劑量組NF-κB、Cleved Caspase-3表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3、表 4。

表4 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

表4 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury（±s）

注：與 Sham 組比較，*P<0.01；與 I/R 組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 I/R 組比較，△P<0.05。

組別 動物數S h a m組 8 I/R組 8 S A L低劑量組 8 S A L中劑量組 8 S A L高劑量組 8 E G B組 8 N F-κ B/β-a c t i n C l e v e d C a s p a s e-3/β-a c t i n 0.2 7±0.0 4 0.0 7±0.0 4 0.4 7±0.0 8* 1.2 5±0.1 6*0.4 2±0.0 9 0.8 7±0.1 4##0.3 7±0.0 6# 0.7 9±0.1 2##0.3 2±0.0 5##△ 0.2 8±0.0 6##△0.3 8±0.0 6# 0.3 6±0.0 8##

圖3 SAL對小腸I/R損傷大鼠腸組織NF-κB、Cleved Caspase-3蛋白表達的影響Fig.3 The effect of SAL on the expression of NF-κB，Cleved Caspase-3 protein in intestinal tissue of rats with small intestinal I/R injury

3 討論

小腸對缺氧缺血非常敏感，小腸I/R損傷在重度感染、創傷、休克、心功能不全等危重疾病病理過程中發揮著重要作用。小腸I/R損傷將導致腸黏膜屏障受損，使腸道毒素和細菌進入血液循環而引發系統性炎癥反應綜合癥，是導致患者死亡的重要因素。因此，防治小腸I/R損傷對改善危重病患者預后至關重要。

丹參以唇形科植物丹參的干燥根和根莖入藥，味苦、性微寒，具有活血祛瘀、通經止痛、涼血消癰之功效。SAL為中藥丹參的水溶提取物，具有良好的抗炎、抗凋亡等生物活性。本實驗采用夾閉腸系膜上動脈的方法復制小腸I/R大鼠模型，該方法制備的動物模型與臨床小腸I/R損傷患者病變特征接近，是目前比較公認的造模方法。本研究發現，小腸I/R損傷模型大鼠腸組織呈現水腫，腸系膜組織結構紊亂、上皮細胞脫落、固有層分離、大量炎性細胞浸潤等病變，與孫孟彪等[14]研究結果一致。進一步研究發現，經SAL干預能夠顯著降低小腸I/R損傷大鼠腸組織含水量，改善腸組織病變、降低Chiu’s氏評分，改善細胞凋亡狀況、降低AI，并且SAL高劑量組對腸組織Chiu’s氏評分、AI的影響優于EGB組，提示SAL對大鼠小腸I/R損傷具有保護作用。

腸I/R損傷將病理性刺激CRP、TNF-α、IL-1β等炎癥因子大量釋放，其中TNF-α、IL-1β作為炎性趨化因子能夠刺激粒細胞進一步合成與釋放炎癥因子，從而引發炎癥級聯反應，導致腸組織燒傷逐漸加重[15]。本研究發現，經SAL干預能夠顯著降低小腸I/R損傷大鼠腸組織CRP、TNF-α、IL-1β水平，并且SAL高劑量組對CRP、TNF-α的影響優于EGB組，提示SAL對大鼠小腸I/R損傷后炎癥反應具有抑制作用。

內質網存在于真核細胞中一種膜性細胞器，具有調節鈣穩態、脂質合成等多種生理作用。但缺血性損傷等將病理性刺激內質網功能紊亂，龐志路等[16]研究發現，內質網應激介導細胞凋亡在小腸I/R損傷的重要病理通路。GRP78是存在于內質網的鈣離子伴侶蛋白，對維持內質網穩態至關重要，GRP78和p-JNK升高可作為內質網應激標志檢測物質[17-18]；內質網應激將誘導促凋亡蛋白CHOP上調表達并激活Caspase-3，進而誘導細胞凋亡[19]。內質網應激能夠誘導 NF-κB 表達[20]，NF-κB 則能夠刺激 CRP、TNF-α、IL-1β等炎癥因子大量釋放，既往研究發現通過藥物抑制NF-κB表達能夠顯著降低缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應[21]。王偉[22]研究發現SAL能夠通過抑制內質網應激介導的細胞凋亡減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，陳裕琳等[23]研究發現丹參能夠通過抑制內質網應激介導的炎癥反應減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究發現，經SAL干預能夠顯著下調小腸 I/R損傷大鼠腸組織GRP78、p-JNK、CHOP、NF-κB、Cleved Caspase-3 蛋白表達，并且SAL 高 劑 量 組 對 GRP78、CHOP、NF-κB、Cleved Caspase-3表達的影響優于EGB組，提示SAL抑制小腸I/R損傷大鼠炎癥反應和細胞凋亡的作用可能與抑制內質網應激有關。

綜上所述，SAL對大鼠小腸I/R損傷具有保護作用，其機制可能與SAL抑制內質網應激通路，進而抑制炎癥反應和細胞凋亡有關。