N-取代四氫異喹啉衍生物的合成及殺多子小瓜蟲研究

姚嘉赟，張成賽，尹文林，藺凌云，潘曉藝，曹 錚，劉憶翰，夏炎春，沈錦玉

( 1.浙江省淡水水產研究所，浙江省魚類健康與營養重點實驗室，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江 湖州 313001； 2.吉林農業大學 動物科技學院，吉林省動物微生態制劑工程研究中心，吉林 長春 130118 )

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬[1]。其生活史分為滋養體、包囊體和掠食體3個階段。滋養體主要寄生在宿主體表，當滋養體發育成熟并離開魚體后，分泌一層透明而有彈性的物質將自身包裹形成包囊，再經有絲分裂形成掠食體，掠食體出包囊后又可感染其他魚體[2]。多子小瓜蟲幾乎可以感染所有淡水魚類，給世界范圍的水產養殖業造成重大經濟損失[3-4]。

疫苗被認為是一種防治多子小瓜蟲病的有效手段，大量研究結果表明，甲醛或者冰凍處理多子小瓜蟲幼蟲滅活疫苗具有一定的免疫保護力[5]，但目前還不能解決多子小瓜蟲離體培養這一難題，難以獲得大量的抗原，因而缺乏實際的可操作性。孔雀石綠(四甲基代二氨基三苯甲烷)和硝酸亞汞被認為是較為有效的殺蟲物質，但因其致癌性目前已被禁用[6]。甲醛[7]、硫酸銅[8]、過氧化氫[9]、過氧乙酸[10]、過碳酸鈉[11]、溴硝醇[12-13]、高鐵酸鉀[14]等被用于控制多子小瓜蟲病，雖有一定功效，但長期使用也會帶來環境污染、藥物殘留、蟲體產生耐藥性等一系列問題。因此，尋找治療多子小瓜蟲病行之有效、環境友好型的藥物迫在眉睫。姚嘉赟等[15-16]用活性追蹤方法從博落回和小果博落回中分離獲得3種苯菲啶異喹啉類化合物血根堿、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，藥效結果顯示，3種物質對多子小瓜蟲具有較強的殺滅作用。同時，構效關系研究初步表明其核心藥效基團主要為四氫異喹啉。因此，筆者以苯乙醇為起始原料，對醇基的α位碳上的氫進行取代，然后經還原、酰化或磺酰化保護氨基，關環，皮克特—施彭格勒反應，脫去保護基團等反應合成3種N-取代四氫異喹啉衍生物，研究其殺蟲功能，以期研制開發新型的殺蟲藥物。

1 材料與方法

1.1 N-取代四氫異喹啉衍生物的合成及鑒定

以對位被不同取代基取代苯乙醇為起始原料，對醇基的α位碳上的氫進行取代，經還原、酰化或磺酰化保護氨基，關環，皮克特—施彭格勒反應，脫去保護基團等反應合成3種四氫異喹啉類衍生物：化合物1(R=CH3NH1-)、化合物2(R=C2H6NH1-)、化合物3[R=CH3(CH2)2NH1-]，并對其進行分離、純化和結構鑒定，合成過程見圖1。

圖1 N-取代四氫異喹啉衍生物的合成過程Fig.1 Synthetic process of N-substituted-tetrahydroisoquinoline derivatives1.R=CH3NH1-； 2.R=C2H6 NH1-； 3.R=CH3(CH2)2NH1-.

1.2 體外殺蟲藥效試驗

1.2.1 蟲體的收集

將嚴重感染多子小瓜蟲的翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)飼養于實驗室的階梯式養殖水槽中，在養殖水槽的底部放入大量自制的蟲體玻璃收集器，待魚體上的多子小瓜蟲游出魚體，沉入水體底部的玻璃收集器后，收集蟲體。一部分蟲體放入22 ℃的培養箱中進行培養，獲取多子小瓜蟲掠食體進行殺蟲試驗。另一部分吸取收集后放入24孔細胞培養皿，進行體外包囊藥物試驗。

1.2.2 藥物對多子小瓜蟲掠食體的體外殺蟲試驗

將合成的所有藥物用二甲基亞砜進行溶解，進而根據預試驗的結果配制不同質量濃度的藥物，化合物1的質量濃度為6、8、10、12、14、16、18、20 mg/L，化合物2的質量濃度為10、12、14、16、18、20、22、24 mg/L，化合物3的質量濃度為10、13、16、19、22、25、28、31 mg/L，吸取150 μL的藥物于24孔細胞培養皿中。收集多子小瓜蟲掠食體，并放置在燒杯中進行稀釋，使其密度約200個/μL，待藥物加入24孔細胞培養皿后于每個藥物孔中加入0.5 μL的蟲體，并用槍頭進行混勻。試驗設置一個空白藥物對照組和一個二甲基亞砜對照組(前期試驗表明藥物中所添加的最高含量二甲基亞砜對多子小瓜蟲掠食體沒有毒性)。每個藥物質量濃度設置3個平行。用藥后觀察多子小瓜蟲的死亡情況，統計每個藥物質量濃度下的4 h死亡率，進而計算殺蟲率(R，%)：

R=n1/n×100%

式中，n1為用藥組死亡蟲數(個)，n為對照組蟲數(個)。

1.2.3 藥物對多子小瓜蟲包囊的體外殺蟲試驗

根據藥物對掠食體的殺滅質量濃度范圍配制不同，并進行殺蟲預試驗，初步確定藥物對包囊的殺蟲質量濃度范圍，設定3種化合物的使用質量濃度為10、20、30、40 mg/L。吸取150 μL的藥物于24孔細胞培養皿中。收集多子小瓜蟲包囊，并放置在燒杯中進行稀釋，使其密度約為60個/μL，待藥物加入細胞培養皿后于每個藥物孔中加入0.5 μL的蟲體，并放置于22 ℃的恒溫恒濕培養箱中，培養20～36 h后，統計各藥物質量濃度組的包囊死亡數量和孵化的幼蟲數量。試驗設置一個空白藥物對照組和一個二甲基亞砜對照組(前期試驗表明藥物中所添加的最高含量二甲基亞砜對多子小瓜蟲掠食體沒有毒性)。每個藥物質量濃度設置3個平行。

1.3 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對翹嘴紅鲌的急性毒性試驗

因化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)對多子小瓜蟲的體外殺蟲效果最強，故而研究其對翹嘴紅鲌的安全性。急性毒性試驗按照文獻[14-15]的方法進行，試驗魚暫養7 d后先進行毒性預試驗，初步確定藥物的毒性試驗質量濃度，并按等對數間距設計7個質量濃度：81.00、72.25、64.00、56.25、49.00、42.25、36.00 mg/L，以下不添加藥物為對照組。試驗控制水溫(25±1) ℃，試驗期間不投飼，及時撈出死魚，每個藥物質量濃度試驗設置3個平行。

根據12、24、48、96 h平均死亡率，利用直線內插法求出半致死質量濃度(LD50)，再計算安全質量濃度(SC)：

SC=(24 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)3

1.4 數據處理

用SPSS 16.0處理藥效數據，以平均數±標準誤表示，采用方差分析進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 合成產物的結構鑒定

對上述合成的3種化合物進行質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等波譜技術進行化學結構鑒定，進而確定化合物合成成功。

化合物1：

電噴霧離子源質譜:m/z—148.5 [M-CN]+；UV(MeOH)—λmax211 (4.42) nm，244(3.91) nm； IR:υmax(KBr, cm-1)—2220(w, C≡N)，1145(s, C-N)。核磁共振氫譜(CD3Cl, TMS)δ: 6.24(1H, d-like,J=8.5 Hz, H-1′), 7.357(7H, m), 5.67(1H, s, H-1), 3.34(1H, td,J=12.0, 4.0 Hz, H-3a), 3.53(1H, dd,J=12.0, 6.5 Hz, H-3b), 3.12(1H, ddd,J=15.8 12.3, 6.0 Hz, H-4a), 2.67(1H, br dd,J=15.8, 2.5 Hz, H-4b)。核磁共振碳譜(CD3Cl)δ: 144.3(C-1′), 115.6 (C≡N), 52.5 (C-1), 46.3 (C-3), 28.8(C-4), 133.2(C-5), 126.8 (C-6), 131.2 (C-7), 126.4 (C-8), 113.7(C-8a)。確定該化合物為2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

化合物2：

電噴霧離子源質譜:m/z—163.8 [M-CN]+；UV(MeOH)—λmax211(4.83) nm，250(4.41) nm；IR:υmax(KBr, cm-1)—2225(w, C≡N)，1152(s, C-N)。核磁共振氫譜 (CD3Cl, TMS)δ: 7.23～7.33(5H, m), 6.71(3H, m), 5.54(1H, s, H-1), 3.69(1H, m, H-3a), 3.49 (1H, m, H-3b), 3.23(1H, ddd,J=16.0, 11.2, 6.0 Hz, H-4a), 2.88 (1H, dt-like,J=6.0, 4.2 Hz, H-4b)。核磁共振碳譜(CD3Cl)δ: 152.4 (C-1′), 149.8 (C-2′), 117.3(C≡N), 52.3(C-1), 44.1(C-3), 28.6 (C-4), 131.4 (C-5), 125.3 (C-6), 133.8 (C-7), 127.1 (C-8), 114.2(C-8a)。確定該化合物為2-乙胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

化合物3：

電噴霧離子源質譜:m/z—176.7 [M-CN]+；UV (MeOH)—λmax251 (4.61) nm；IR:υmax(KBr, cm-1)—2225 (w, C≡N)，1148(s, C-N)；核磁共振氫譜 (CD3Cl, TMS)δ:7.29 (6H,m), 6.99 (2H, m), 5.47(1H, s, H-1), 3.71 (1H, m, H-3a), 3.48 (1H, m, H-3b), 3.16 (1H, m, H-4a), 2.94(1H, dd,J=6.5, 3.0 Hz, H-4b)；核磁共振碳譜(CD3Cl) δ: 147.0(C-1′), 128.7 (C-2′), 130.5 (C-3′), 117.5 (C≡N), 52.8 (C-1), 45.2 (C-3), 29.7 (C-4), 132.3 (C-5), 126.1 (C-6), 134.2 (C-7), 126.8 (C-8), 113.9 (C-8a)。確定該化合物為2-異丙基胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈。

2.2 N-取代四氫異喹啉衍生物對多子小瓜蟲掠食體的殺滅作用

合成的3種化合物在10～31 mg/L內對多子小瓜蟲掠食體均具有一定的殺滅作用(圖2)。而殺蟲效果最好的為化合物1(2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質量濃度為20.0 mg/L時，在4 h即可殺滅100%幼蟲，其4 h的半數致死質量濃度為11.6 mg/L，其次是化合物2 (2-乙胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質量濃度為24.0 mg/L時殺滅率為100%，其4 h的半數致死質量濃度為 15.1 mg/L。殺蟲效果最差的為化合物3 (2-異丙基胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈)，其質量濃度為31.0 mg /L時殺滅率為100%，其4 h的半數致死質量濃度為18.2 mg/L。

圖2 化合物1～3對多子小瓜蟲掠食體的殺滅作用(4 h)Fig.2 Anti-parasitic efficacy of compounds 1—3 against I. multifiliis theronts in 4 h exposure

體外殺蟲試驗結果還顯示，3種N-取代四氫異喹啉衍生物對多子小瓜蟲掠食體具有一定的細胞結構破壞作用，多子小瓜蟲掠食體在接觸藥物4 h后，其表面纖毛不可見，細胞縮小，部分細胞破碎胞質流出。而對照組結構完好，纖毛運動正常，胞內器官明顯，蟲體運動及活力正常(圖3)。

圖3 異喹啉衍生物作用多子小瓜蟲掠食體后的顯微結構(20×)Fig.3 Microstructures of I. multifiliis theronts treated with etrahydroisoquinoline derivatives (20×)a.藥物作用4 h后; b.正常多子小瓜蟲掠食體.a.theronts treated with drug for 4 h; b.normal theronts.

2.3 N-取代四氫異喹啉衍生物對多子小瓜蟲包囊體的殺滅作用

3種N-取代四氫異喹啉衍生物對多子小瓜蟲包囊的殺滅作用見表1。合成的3種化合物在所測的質量濃度范圍內對多子小瓜蟲的包囊均具有殺滅或抑制作用。殺蟲效果最好的為化合物1，其質量濃度為40.0 mg/L時，在6 h即可殺滅100%包囊，其次是化合物2，其質量濃度為40.0 mg/L時殺滅率為70.0%。殺蟲效果最差的為化合物3，其質量濃度為40.0 mg/L時殺滅率為63.3%。由此可知，隨著N-取代基團碳鏈的延長其殺蟲效果不斷降低。

表1 化合物1～3對多子小瓜蟲包囊的成活和孵化影響(6 h)Tab.1 The survival and hatching of I. multifiliis tomonts exposed to compounds 1—3 for 6 h

2.4 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對翹嘴紅鲌的急性毒性試驗

2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對翹嘴紅鲌的急性毒性試驗結果見表2，由直線內插法計算可得，2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對翹嘴紅鲌的24 h的半致死質量濃度為66.57 mg/L，48 h的半致死質量濃度為62.78 mg/L，96 h的半致死質量濃度為51.0 mg/L。根據公式計算可得，其安全質量濃度為16.75 mg/L。

表2 2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈對翹嘴紅鲌的急性毒性Tab.2 The acute toxicity of 2-methylamino-1,2,3,4-tetrahydrois-oquinoline-formonitrile to topmouth culter E. ilishaeformis

3 討 論

3.1 異喹啉衍生物的殺蟲構效關系

異喹啉及異喹啉的衍生物是一類重要的醫藥化工中間體，它被廣泛應用于各種重要醫用藥物。姚嘉赟等[16-18]已獲得多種具有殺指環蟲和多子小瓜蟲的異喹啉類生物堿。分析各類異喹啉類生物堿的結構可以發現，絕大部分該類生物堿均存在異喹啉或者異喹啉衍生物的基本框架結構。因此，異喹啉這個基本框架極有可能是殺蟲的主要藥效基團，故而筆者以苯乙醇為起始原料合成了3種異喹啉類衍生物，體外殺蟲藥效結果也顯示了預期的設想，這從側面證實了異喹啉有可能是殺蟲的主要藥效基團。同時，體外殺蟲試驗結果還顯示，隨著N-取代基團碳鏈的延長其殺蟲效果明顯降低。Wen等[19]研究也表明，側鏈糖基的數量影響著殺多子小瓜蟲的藥效結果，糖基數量越多其殺蟲效果越差。

3.2 異喹啉衍生物的殺蟲活性

體外試驗結果表明，3種異喹啉衍生物可造成多子小瓜蟲蟲體細胞結構的破壞、纖毛脫落以及胞質外流，這與孔雀石綠作用于多子小瓜蟲的現象基本相同[20]。近期的研究結果表明，異喹啉類生物堿對細胞毒性的作用位點主要是細胞的線粒體，它可誘導HL-60細胞的凋亡，其對細胞的誘導凋亡作用主要是通過線粒體的多誘導凋亡途徑實現[21]。線粒體在調控細胞凋亡以及凋亡和壞死性細胞死亡造成的功能性損失方面起著重要的作用[22]。這可能是本研究中3種化合物殺蟲的作用機理之一。蘆程等[23]研究表明，異喹啉生物堿血根堿對指環蟲的殺蟲機理是其對蟲體內的抗氧化系統造成損害，進而導致蟲體體表結構損壞，合胞體、分泌顆粒、線粒體減少，體壁頂部質膜損壞，進而造成基板致密結構變得稀疏，形成許多孔洞，進而造成蟲體破裂。而本試驗中，異喹啉衍生物對多子小瓜蟲掠食體用藥6 h后造成其胞質外流、細胞破碎，其作用機理也可能是改變了蟲體的抗氧化系統，但其具體的作用位點、作用模式和作用機制還需進一步研究。

綜上所述，筆者以苯乙醇為起始化合物合成了3個N-取代四氫異喹啉類化合物，這3種化合物對多子小瓜蟲幼蟲和包囊均有較好的殺滅效果，且隨著N-取代基團碳鏈的延長其殺蟲效果不斷降低，這可為將來該類殺蟲化合物的合成提供一定的借鑒作用。

4 結 論

以苯乙醇為原料合成3種N-取代四氫異喹啉衍生物，其中，2-甲胺基-1,2,3,4-四氫異喹啉-1-甲腈殺多子小瓜蟲活性最強,且該化合物對魚類的毒性較低，具有較好的開發潛力。