眼咽型肌營養(yǎng)不良癥一家系臨床及分子生物學特征分析

黃鎧 李文武 劉紅仙 孫浩 李志宏 褚嘉祐 楊昭慶

眼咽型肌營養(yǎng)不良癥（OPMD）是一種晚發(fā)型常染色體顯性或隱性遺傳性肌肉病，臨床主要表現(xiàn)為成年發(fā)病的進行性眼瞼下垂、吞咽困難和肢體無力等，較少伴神經(jīng)系統(tǒng)病變［1］。其發(fā)病與PABPN1基因外顯子1（GCG）異常重復擴增或（GCA）插入導致的PABPN1基因在肌細胞胞核內(nèi)形成類淀粉絲樣結構有關［2］。目前國內(nèi)外均有報道，歐美等發(fā)達國家患病率較高，亞洲國家中以日本患病率最高，我國僅為個案報道［2］，明確診斷依靠臨床特點及PABPN1基因檢測。男女均可發(fā)病，高峰發(fā)病年齡為40歲后，核心癥狀為眼瞼下垂和吞咽困難，病情進展緩慢，首發(fā)癥狀通常為眼瞼下垂，數(shù)年后可出現(xiàn)吞咽困難和構音障礙，飲水嗆咳少見，亦有少數(shù)患者以吞咽困難為首發(fā)癥狀［3］；實驗室檢查血清肌酸激酶（CK）水平正常或輕度升高［2］；骨骼肌CT或MRI檢查顯示椎旁肌、腰大肌、背部深部肌群萎縮以及肢體遠端和近端肌肉受累［2］；肌肉組織活檢可為鑒別診斷和基因診斷提供線索［4-6］；絕大多數(shù)患者肌電圖呈肌源性損害，少數(shù)可見動作電位時限增寬和波幅增高等神經(jīng)損傷表現(xiàn)［7-8］。檢測手段的增加及檢測技術的進步可為疾病診斷提供更多依據(jù)。1998年，Brais等［4］的連鎖分析顯示，OPMD患者第14號染色體長臂（14q11.2）PABPN1基因外顯子1由正 常 的（GCG）6（GCA）3（GCG）擴 增 為（GCG）8～13（GCA）3（GCG）。2011年 ，Robinson等［9］發(fā) 現(xiàn) ，PABPN1基因外顯子1存在點突變（35G＞C）。GCA、GCT、GCC、GCG均 編 碼 丙 氨 酸［10］，因 此 以GCN代表上述四種中任意一種，正常等位基因（GCG）6即以（GCN）10替代，常染色體顯性遺傳性OPMD患者PABPN1基因通常為（GCN）12～17，而歐美和日本OPMD家系的基因變異類型以（GCN）13居多，約占40%，其次為（GCN）14和（GCN）15，分別占26%和21%，而（GCN）12、（GCN）16和（GCN）17較少見［4］，其中 ，（GCN）13［11］和（GCN）15［12］在 我 國 均 有 報 道 。（GCN）17基因型患者較（GCN）12基因型發(fā)病年齡更早、病情更嚴重，尤以顯性遺傳性純合子基因型癥狀最嚴重，純合子（GCN）13的臨床癥狀較雜合子（GCN）13和純合子（GCN）11更嚴重［5-6］。常染色體隱性遺傳性OPMD的PABPN1基因純合子（GCN）17發(fā)病較晚且癥狀較輕，而（GCN）13變異和雜合子（GCN）11較純合子（GCN）11的臨床表型更嚴重［4］。本研究收集并分析一常染色體隱性遺傳性OPMD家系的臨床及分子生物學特點，進一步補充疾病的臨床表型異質性。

對象與方法

一、研究對象

征得先證者及其親屬知情同意后，選擇2019年12月在中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所經(jīng)基因檢測明確診斷的OPMD患者3例及其直系親屬3名，分別為先證者（Ⅱ3）、先證者之大姐（Ⅱ1）、先證者二姐（Ⅱ2）、先證者四弟（Ⅱ4）、先證者之五妹（Ⅱ5）、先證者之六妹（Ⅱ6），均來自云南省楚雄彝族自治州的同一家系（圖1）。其中，男性2例，女性4例；年齡50～65歲，平均58歲。

圖1 OPMD患者家系圖Figure 1 Family pedigree of patients with OPMD.

二、研究方法

1.臨床資料采集 詳細記錄先證者一般情況（包括性別、年齡、首發(fā)癥狀、臨床主要表現(xiàn)等）、既往史、個人史、家族史、體格檢查以及各項輔助檢查結果。

2.基因檢測 采集6例家族成員外周靜脈血各2 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，采用Axygen血液基因組DNA分離試劑盒［愛思進生物技術（杭州）有限公司］提取血液基因組DNA。根據(jù)GenBank數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）獲取PABPN1基因（NC_000014.9）外顯子1全序列，采用Primer 5.0軟件設計聚合酶鏈反應（PCR）引物，于昆明碩擎生物科技有限公司合成上游引物（F）：5'-CGCAGTGCCCCGCCTTAGA-3'、下游引物（R）：5'-ACAAGATGGCGCCGCCCCGGC-3'。以基因組DNA作為模板對目標基因序列行PCR擴增，PCR反應體系：基因組DNA（90 ng）4μl，10 mmol/L上游和下游引物各0.50μl，5 U/μl LA Taq 0.30μl，2×TSINGKE Master Mix（北京擎科生物科技有限公司）12.50μl，去離子水補足體系至25μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min、67℃退火40 s、72℃延伸1 min，共循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.50%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，行Sanger測序。PCR產(chǎn)物采用p DE1 Directional Expression Kit Ver.2試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）進行TA克隆以分析基因變異。

結 果

一、臨床表型

先證者（Ⅱ3）體格檢查：神志清楚，精神狀態(tài)正常，發(fā)育正常，營養(yǎng)中等；對光反射靈敏，眼動充分，無眼震；雙側鼓腮對稱有力，雙側軟腭上提受限，懸雍垂居中，伸舌居中，無舌肌萎縮、纖顫，咽反射減弱，吞咽動作緩慢，頸部柔軟，四肢肌力和肌張力正常，深淺感覺正常，生理反射正常，病理征呈陰性，腦膜刺激征陰性。實驗室檢查：血清CK 128 U/L（40～200 U/L），乳酸脫氫酸（LDH）為200 U/L（20～250 U/L），肝腎功能試驗和甲狀腺功能試驗均于正常值范圍；新斯的明試驗陰性。肌電圖和頭部MRI檢查均未見異常。進一步追問先證者病史及家族史，得知該家系中連續(xù)兩代成員均有OPMD患者，具有顯性遺傳模式特點：先證者之父50歲發(fā)病，首發(fā)癥狀為眼瞼下垂，進行性加重伴吞咽困難，于70歲死亡（死因不詳）；先證者（Ⅱ3）及其二姐（Ⅱ2）、四弟（Ⅱ4）為子代中發(fā)病并生存的患者，發(fā)病年齡為53～57歲，平均55.33歲；均以眼瞼下垂為首發(fā)癥狀（圖2），進行性加重，并于3～5年后出現(xiàn)吞咽困難。該家系中4例OPMD患者的臨床資料參見表1。

表1 家系中4例OPMD患者的臨床資料Table 1.Clinical data of 4 pedigree patients with OPMD

圖2 OPMD家系成員眼肌表現(xiàn) 2a 先證者出現(xiàn)眼瞼下垂 2b 先證者之二姐出現(xiàn)眼瞼下垂 2c 先證者之大姐眼肌表現(xiàn)正常Figur e 2 Clinical manifestations of ocular muscles in family members of OPMD The proband had drooping eyelids(Panel 2a).The second sister of the proband had drooping eyelids(Panel 2b).The proband's elder sister was normal muscle function(Panel 2c).

二、基因檢測結果

該家系中6位家族成員的Sanger測序結果顯示，先證者之大姐（Ⅱ1）、六妹（Ⅱ6）PABPN1基因無異常，PABPN1基因外顯子1的堿基序列為（GCN）10，即（GCG）（6GCA）（3GCG），共編碼6個（GCG）丙氨酸重復序列，TA克隆測序峰圖以單峰呈現(xiàn)；其余4位家族成員PABPN1基因外顯子1均出現(xiàn)3個（GCG）異常重復擴增，為雜合子（GCN）10（/GCN）1（3圖3），其中先證者（Ⅱ3）及其二姐（Ⅱ2）、四弟（Ⅱ4）已出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，先證者之五妹（Ⅱ5）尚未出現(xiàn)相應臨床癥狀。最終先證者診斷為OPMD，該家系明確為OPMD家系。

圖3 PABPN1基因檢測結果 3a 正常PABPN1基因型（GCN）10，即（GCG）（6GCA）（3GCG） 3b 先證者存在PABPN1基因雜合突變，可見突變區(qū)野生型和突變型等位基因波峰重疊 3c 先證者PABPN1基因經(jīng)TA克隆測序呈（GCN）13，即（GCG）（9GCA）（3GCG），增加3個（GCG）異常重復擴增（紅框所示），其基因型為（GCN）10（/GCN）13Figur e 3 PABPN1 gene detection findings PABPN1 normal genotype(GCN)10:(GCG)6(GCA)3(GCG)(Panel 3a).The PABPN1 gene of the proband was mutated to heterozygous,and the wild-type and mutant allele peaks overlap in the mutant region(Panel 3b).The PABPN1 gene of the proband was sequenced by TA cloning and sequencing showed(GCN)13:(GCG)9(GCA)3(GCG)was abnormally amplified,an increase of 3(GCG),which genotype was(GCN)10/(GCN)13(red box indicates,Panel 3c).

討 論

本文家系中男女均有發(fā)病，發(fā)病年齡＞50歲，以眼瞼下垂為首發(fā)癥狀，進行性加重伴吞咽困難，但肢體肌力和肌張力正常、新斯的明試驗陰性，PABPN1基因檢測提示基因型為（GCN）10（/GCN）13，結合臨床表現(xiàn)和基因檢測結果，最終先證者（Ⅱ3）及其二姐（Ⅱ2）、四弟（Ⅱ4）診斷為OPMD，該家系明確為OPMD家系。

OPMD發(fā)病隱蔽，多數(shù)為顯性遺傳模式，少數(shù)呈隱性遺傳模式，發(fā)病年齡較晚，眼瞼下垂和吞咽困難為主要臨床表現(xiàn)，但二者出現(xiàn)時間不同，因此應注意與老年性重癥肌無力（MG）、老年性眼瞼下垂、眼咽遠端型肌病（OPDM）相鑒別：老年性重癥肌無力和老年性眼瞼下垂的主要癥狀為眼瞼下垂，但老年性重癥肌無力新斯的明試驗呈陽性；OPDM的致病機制與GIPC1基因5’非翻譯區(qū)（GCN）異常重復擴增相關［13］；但上述3種疾病PABPN1基因檢測均正常。

PABPN1基 因 型（GCN）10（/GCN）13廣 泛 見 于OPMD家系［4］，（GCN）重復擴增數(shù)目與臨床癥狀無顯著關聯(lián)性［2，7］，但是不同基因型的臨床癥狀存有差異。一項針對法國地區(qū)354例OPMD患者的研究發(fā)現(xiàn)，其（GCN）重復擴增數(shù)目可影響疾病嚴重程度和進展［14］。有文獻報道，眼瞼下垂常是攜帶（GCN）14的男性OPMD患者的首發(fā)癥狀［15］。OPMD患者肌肉受累部位及程度有一定的家族聚集性［16］，本文家系均以眼瞼下垂為首發(fā)癥狀，進行性加重伴吞咽困難。患者矯正眼瞼下垂后可發(fā)生嚴重眼部并發(fā)癥，推測可能是由于眼球拉傷和眼肌麻痹，暫時性拉繩縫合術是治療眼部并發(fā)癥的有效方法［17］。對于吞咽困難的患者，癥狀改善維持時間是選擇手術治療的關注點［18］。OPMD患者肌肉組織病理學可見兩種類型包涵體，一種為核內(nèi)管狀細絲樣包涵體，呈柵欄樣排列，為OPMD所特有；另一種為管絲樣包涵體［19］，常用于未行基因診斷前的病理診斷。體外研究和動物實驗顯示，丙戊酸對OPMD肌細胞和蠕蟲模型具有保護作用，提示其治療有效［20］；在OPMD小鼠模型中測試的一種基因療法，可以恢復PABPN1基因在肌細胞胞核內(nèi)形成的核內(nèi)包涵體，并防止肌纖維化和肌萎縮，以使肌肉力量恢復至健康水平，從而展現(xiàn)基因治療的良好應用前景［21］。

本文家系中具有臨床癥狀的家族成員基因檢測顯示，PABPN1基因外顯子1中3個（GCG）丙氨酸的異常重復擴增的基因型（GCN）10（/GCN）13，從而證實為OPMD家系，提示云南人中存在PABPN1基因變異。既往研究提示，部分地區(qū)OPMD的基因變異可能具有“奠基者”效應［22-24］，目前我國報道的OPMD患者大多為相同基因型，但臨床表現(xiàn)明顯不同，進一步表明OPMD具有臨床表型異質性［25］。由于目前尚缺乏基因治療和特異性藥物，對癥處理或手術治療是改善臨床癥狀和生活質量的常見方法。通過積累更多地區(qū)和人群中的病例臨床表型和基因變異數(shù)據(jù)，并結合肌肉組織活檢等臨床檢測，可以為該病的分子病理學機制、臨床診斷與治療、預后，以及家族遺傳咨詢提供更全面的信息。

利益沖突無