ACT001通過抑制P65磷酸化降低膠質母細胞瘤細胞程序性死亡蛋白配體1的表達

張錦浩 劉沛東 張辰 李佳博 任梟 陳露露 孫錦章 王旭亞 張亮 楊學軍

膠質瘤是臨床最常見的顱內原發性中樞神經系統腫瘤，其中以多形性膠質母細胞瘤（GBM）惡性程度最高，約占原發性中樞神經系統惡性腫瘤的47.1%［1］。盡管以保護神經功能為前提的最大范圍手術切除腫瘤，聯合術后同步放化療和替莫唑胺序貫化療，以及腫瘤電場治療（TTF）［2-3］的應用可以改善預后，但遺憾的是，膠質母細胞瘤患者5年生存率僅為5.5%，其中位生存期也僅為14.6個月［4］，主要是由于中樞神經系統特有的血-腦屏障結構和膠質母細胞瘤特殊的免疫抑制微環境所致。有研究顯示，免疫檢查點如細胞程序性死亡蛋白1（PD1）及其配體（PDL1）［5］、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）［6］在膠質母細胞瘤中呈高表達，且與不良預后密切相關。因此，免疫治療仍是改善膠質瘤患者預后的重要策略。從白菊分離出來的小白菊內酯（PTL）具有廣泛的抗炎癥和抗腫瘤作用［7］，但其在酸性和堿性條件下不穩定，水溶性差，口服生物利用率低［8］，通過改進其化學結構獲得的含笑內酯（MCL）及其衍生物二甲氨基含笑內酯（DMAMCL）富馬酸鹽即ACT001，具有相對分子量低、穩定性強、易溶于水、毒性作用小、血-腦屏障通透性高等優點，可抑制膠質瘤的生長［9-10］。業已證實，PTL可以顯著抑制核因子-κB（NF-κB）和信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）信號轉導通路活性［11］。NF-κB作為轉錄因子，通過直接調控下游基因表達或與其他信號轉導通路交聯作用，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用，已知其在乳腺癌和結腸癌中通過轉錄后調節以調控PDL1的表達［12-13］。鑒于此，本研究探究ACT001是否能夠通過抑制膠質母細胞瘤細胞NF-κB信號轉導通路活性，下調PDL1表達，改善免疫抑制微環境，進而抑制膠質母細胞瘤進展。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞來源 人膠質瘤細胞系U87購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，在天津醫科大學總醫院神經病學研究所液氮中常規保存。

2.試劑與設備 （1）藥品與試劑：ACT001由南開大學藥學院提供，DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒為上海東仁化學科技公司產品，Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑購自美國Thermo公司，小干擾RNA（siRNA）由蘇州吉瑪基因股份有限公司提供，P65和兔抗人單克隆抗體（1∶200）為美國CST公司產品，Alexa Fluor 594標記的驢抗兔熒光IgGⅡ抗（1∶1000）由美國Invitrogen公司提供，體積分數為1%的TritonX-100溶液、RIPA裂解液［按1∶100比例加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制劑］和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，Trizol溶液為美國Ambion公司產品，實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（Master Mix試劑盒）和逆轉錄試劑盒為美國Promega公司產品，Ⅰ抗工作液包括兔抗人P65和磷酸化P65（p-P65）單克隆抗體（1∶1000）購自美國CST公司、兔抗人PDL1單克隆抗體（1∶1000）購自美國Abcam公司、內參照物小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（1∶1000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgGⅡ抗（1∶3000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。（2）儀器與設備：含5%二氧化碳的37℃恒溫培養箱由德國Heraeus公司提供，Synergy 2多功能酶標儀由美國BioTek公司提供，IX73倒置相差熒光顯微鏡為美國Olympus公司產品，凝膠成像分析系統購自美國BD公司。

二、實驗方法

1.生物信息學分析 腫瘤基因組學圖譜計劃（TCGA）數 據 從 其 官 網（https：//cancergenome.nih.gov/）下載，包含695例膠質瘤患者和5例正常對照者的轉錄組測序（RNA-seq）結果及其中605例膠質瘤患者的總生存期（OS）；中國腦膠質瘤基因組學圖譜計劃（CGGA）數據從其官網（http：//www.cgga.org.cn/）下載，包含325例膠質瘤患者的RNA-seq測序結果及其中222例患者的總生存期。采用R語言數據分 析 軟 件（R version 4.0.2，https：//www.R-project.org/）分析TCGA和CGGA數據庫中膠質瘤病理分級和預后與P65和PDL1 mRNA表達量的關系，其中，圖 形 繪 制 使 用ggplot程 序 包（https：//ggplot2.tidyverse.org），生存分析使用survival程序包（https：//CRAN.R-project.org/package=survival）和survminer程序 包 （https：//CRAN.R -project.org/package=survminer），統計分析使用ggsignif程序包（https：//CRAN.R-project.org/package=ggsignif）。

2.CCK-8法檢測細胞增殖活性 將U87細胞接種于96孔板，細胞接種數目為2000個/孔，每組置設6個平行孔，置于含5%二氧化碳的37℃恒溫培養箱中接種12 h，抽干原培養基，更換為含不同濃度ACT001的培養基100μl，ACT001終濃度分別為5、10、20、40、80、160和320μmol/L；同時設置空白對照組（無U87細胞）和正常對照組（含U87細胞但不滴加ACT001）。各組細胞均置于細胞培養箱中培養48 h，每孔加入CCK-8溶液10μl，靜置2 h后于酶標儀上測定450 nm處光密度值（OD值），計算細胞抑制率，細胞抑制率（%）=［（正常對照孔OD450nm-實驗孔OD450nm）/（正常對照孔OD450nm-空白對照孔OD450nm）］×100%，再采用GraphPad軟件（http：//www.graphpad.com/）繪制細胞抑制率與ACT001濃度的標準曲線，并計算ACT001半數抑制濃度（IC50）。

3.免疫熒光法檢測P65蛋白在U87細胞中的定位變化 經50μmol/L ACT001處理的U87細胞和正常對照組U87細胞培養48 h后，去除培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）快速沖洗5 min（×3次），滴加體積分數為4%的多聚甲醛溶液固定10 min，磷酸鹽緩沖液搖洗5 min（×3次），加入體積分數為1%的TritonX-100溶液室溫通透10 min，磷酸鹽緩沖液搖洗5 min（×3次），滴加體積分數為5%的山羊血清于37℃封閉1 h，棄血清，加入兔抗人P65單克隆抗體（1∶200），4℃過夜孵育，次日棄Ⅰ抗，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次）后加入Alexa Fluor 594標記的驢抗兔熒光IgGⅡ抗（1∶1000），避光濕盒孵育1 h后，棄Ⅱ抗，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次）后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室溫靜置5 min，以抗熒光衰減劑封片，避光條件下于倒置相差熒光顯微鏡下觀察，呈紅色熒光的細胞即為P65蛋白的定位。

4.siRNA轉染U87細胞 首先將U87細胞接種于6孔板，細胞接種數目為（80～100）×103個/孔，當細胞密度達60%～80%時進行轉染。轉染前，先將6孔板中完全培養基更換為無血清培養基，置于細胞培養箱中培養30 min，每孔準備2支1.50 ml無菌EP管，一支加入100μl無血清培養基+6μl Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑（A管），另一支加入100μl無血清培養基+150 pmol siRNA（B管）。將A管的轉染試劑培養基混合物滴加至B管的siRNA培養基混合物，混勻，室溫靜置15～20 min后立即轉染；將200μl混合物分別滴加至各自6孔板，混勻，P65 siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司進行設計合成，P65干擾序列1（si-P65-1組）為5'-GAUGAAGACUUCUCCUCCATT-3'、P65干擾序列2（si-P65-2組）為5'-CAGAUACAGACGAUCGUCATT-3'、 無 義 序 列 （si-NC 組 ） 為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，轉染12 h后更換為完全培養基繼續培養48 h。

5.實時定量聚合酶鏈反應檢測P65蛋白敲低效率 經siRNA轉染的U87細胞置于含5%二氧化碳的37℃恒溫培養箱中培養48 h，Trizol溶液提取RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明逆轉錄為cDNA，行qRT-PCR，PCR引物序列為，P65正向引物序列：5'-AAGATCTGCCGAGTGAACCG-3'、反向引物序列：5'-GCCTGGTCCCGTGAAATACA-3'，內參照物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物序列：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'、反 向 引 物 序列：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。反應體系共20μl，主要包括cDNA 1μl、正向和反向引物各為1μl、2×Master Mix 10μl、DEPC水7μl。反應條件為95℃預變性3 min，循環1次；95℃15 s，60℃1 min，共循環40次。以GAPDH為內參照物計算P65蛋白相對表達量，計算公式為：相對表達量=2-（ΔCT實驗組目的RNA-ΔCT對照組目的RNA）。

6.Western blotting法檢測目的蛋白相對表達量 經25和50μmol/L ACT001處理的U87細胞以及正常對照組U87細胞培養48 h后，RIPA裂解液（按1∶100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度后，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），采用聚偏二氟乙烯（PVDF）轉膜以及牛奶封閉后，滴加Ⅰ抗工作液，包括兔抗人P65、p-P65和PDL1單克隆抗體以及內參照物小鼠抗人β-actin單克隆抗體（均1∶1000），4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgGⅡ抗（1∶3000）。凝膠成像分析系統采集P65、p-P65和PDL1條帶結果，并采用Image J軟件進行量化分析，以β-actin作為內參照物，計算目的蛋白的相對表達量。

7.統計分析方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理與分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

結 果

生物信息學分析顯示，正常對照者P65和PDL1 mRNA表達量極低，膠質瘤患者P65和PDL1 mRNA表達量增加且隨腫瘤病理分級的升高而呈上升趨勢，差異有統計學意義（均P＜0.05，圖1）；膠質瘤患者中P65和PDL1高表達組生存率和生存期均低于低表達組且差異具有統計學意義（均P＜0.05，圖2）。

圖1 生物信息學分析結果 1a TCGA數據庫中正常對照者P65和PDL1 mRNA表達量極低，膠質瘤患者P65和PDL1 mRNA表達量增加且隨腫瘤病理分級的升高而呈上升趨勢 1b CGGA數據庫中膠質瘤患者P65和PDL1 mRNA表達量隨腫瘤病理分級的升高而增加Figure 1 Bioinformatics analysis results The mRNA expression levels of P65 and PDL1 in TCGA database were extremely low in normal controls,but increased in glioma patients and showed an upward trend with the increase of tumor pathological grade(Panel 1a).Gliomas with higher pathological grade showed higher P65 and PDL1 expression in CGGA database(Panel 1b).

圖2 生物信息學分析結果 2a TCGA數據庫中膠質瘤患者P65 mRNA高表達組生存率和生存期均低于低表達組（P=0.05）2b TCGA數據庫中膠質瘤患者PDL1 mRNA高表達組生存率和生存期均低于低表達組（P=0.000）2c CGGA數據庫中P65 mRNA高表達組生存率和生存期均低于低表達組（P=0.001）2d CGGA數據庫中PDL1 mRNA高表達組生存率和生存期均低于低表達組（P=0.000）Figure 2 Bioinformatics analysis results In TCGA database,the survival rate and survival time in the group with high P65 mRNA expression in glioma patients were lower than those in the group with low expression(P=0.05,Panel 2a).In TCGA database,the survival rate and survival time in the group with high PDL1 mRNA expression in glioma patients were lower than those in the group with low expression(P=0.000,Panel 2b).In CGGA database,the survival rate and survival time of the group with high P65 mRNA expression were lower than those of the group with low expression(P=0.001,Panel 2c).In CGGA database,the survival rate and survival time of the group with high PDL1 mRNA expression were lower than those of the group with low expression(P=0.000,Panel 2d).

細胞增殖活性檢測結果顯示，經不同藥物濃度ACT001（5、10、20、40、80、160和320μmol/L）處理后，U87細胞抑制率分別為（9.01±4.75）%、（17.03±2.91）%、（28.50±4.85）%、（45.50±5.15）%、（67.67±8.46）%、（83.02±5.79）%和（94.33±1.59）%，從而最終得出ACT001對U87細胞的半數抑制濃度為42.98μmol/L（圖3）。

圖3 細胞抑制率與ACT001濃度的標準曲線顯示，隨著ACT001藥物濃度的升高，U87細胞抑制率逐漸升高Figure 3 CCK-8 results suggested that ACT001 inhibited the proliferation of U87 cells in a dose-dependent manner.

免疫熒光染色顯示，與正常對照組相比校，經50μmol/L ACT001處理的U87細胞P65蛋白入核減少，表明ACT001主要通過減少P65蛋白入核以抑制NF-κB信號轉導通路活性（圖4）。

圖4 倒置相差熒光顯微鏡顯示，正常對照組和ACT001 50μmol/L組P65蛋白的表達定位變化，經50μmol/L ACT001處理后P65蛋白入核減少 免疫熒光染色 ×400Figure 4 Inverted phase contrast fluorescence microscopy showed the P65 expression and localization in U87 glioma cells in control group and ACT001 50μmol/L group:the nuclear translocation was reduced in the ACT001 50μmol/L group.Immunofluorescence staining ×400

qRT-PCR反應顯示，不同siRNA轉染組U87細胞P65 mRNA表達量差異具有統計學意義（P=0.000，表1）。兩兩比較結果顯示，si-P65-1組（t=13.290，P=0.000）和si-P65-2組（t=12.730，P=0.000）P65 mRNA表達量低于si-NC組。si-P65-1組與si-P65-2組差異無統計學意義（t=0.852，P=0.427），表明si-P65-1組和si-P65-2組較si-NC組敲低P65蛋白的效果顯著。

表1 不同siRNA轉染組U87細胞P65 mRNA表達量的比較（±s）Table 1.Comparison of P65 mRNA expression in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

表1 不同siRNA轉染組U87細胞P65 mRNA表達量的比較（±s）Table 1.Comparison of P65 mRNA expression in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

組別 例數P65 mRNAF值P值si-NC組31.000 si-P65-1組30.152±0.007164.2000.000 si-P65-2組30.166±0.031

Western blotting法顯示，不同siRNA轉染組U87細胞P65（P=0.000）、p-P65（P=0.000）和PDL1（P=0.002）相對表達量差異具有統計學意義（表2）。兩兩比較顯示，si-P65-1組和si-P65-2組P65（P=0.000，0.000）、p-P65（P=0.000，0.000）和PDL1（P=0.004，0.003）相對表達量低于si-NC組，si-P65-1組與si-P65-2組之間差異無統計學意義（均P＞0.05；表3，圖5），表明減少U87細胞P65磷酸化水平，可以抑制PDL1的表達。不同濃度藥物處理組U87細胞P65相對表達量差異無統計學意義（P=0.904），然而，p-P65（P=0.000）和PDL1（P=0.000）的相對表達量差異均具有統計學意義（表4），其中，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65（P=0.000，0.000）和PDL1（P=0.000，0.000）相對表達量均低于正常對照 組 ，ACT001 50μmol/L組p-P65（P=0.006）和PDL1（P=0.046）相對表達量亦低于25μmol/L組（表5，圖6），表明ACT001對P65的表達無明顯影響，但抑制P65磷酸化和PDL1表達，且呈現藥物濃度依賴性。

圖6 Western blotting法結果顯示，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65和PDL1相對表達量均低于正常對照組且呈藥物濃度依賴性，而P65相對表達量無明顯變化Figure 6 Western blotting showed the relative expression of p-P65 and PDL1 in the ACT001 treatment groups were lower than those in the control group in a dose-dependent manner,while the relative expression of P65 showed no difference.

表4 不同濃度藥物處理組U87細胞P65、p-P65和PDL1蛋白相對表達量的比較（±s）Table 4.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells of different treatment groups

表4 不同濃度藥物處理組U87細胞P65、p-P65和PDL1蛋白相對表達量的比較（±s）Table 4.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells of different treatment groups

組別 例數P65p-P65PDL1正常對照組（1）31.0001.0001.000 ACT00130.979±0.0860.720±0.0200.571±0.048 25μmol/L組（2）ACT00130.957±0.1390.607±0.0230.444±0.041 50μmol/L（3）F值0.102269.700128.800 P值0.9040.0000.000

表5 不同濃度藥物處理組U87細胞P65、p-P65和PDL1相對表達量的兩兩比較Table 5.Pairwise comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 among different treatment groups

圖5 Western blotting法顯示，si-P65-1組和si-P65-2組P65、p-P65和PDL1相對表達量均低于si-NC組Figure 5 Western blotting showed the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in si-P65-1 and si-P65-2 groups were lower than those in si-NC group.

表2 不同siRNA轉染組U87細胞P65、p-P65和PDL1相對表達量的比較（±s）Table 2.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

表2 不同siRNA轉染組U87細胞P65、p-P65和PDL1相對表達量的比較（±s）Table 2.Comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 in U87 cells transfected with different siRNA(±s)

p-P65，phospho-P65，磷 酸化P65；PDL1，programmed cell death protein ligand 1，細胞程序性死亡蛋白配體1。The same for tables below

組別 例數P65p-P65PDL1 si-NC組（1）31.0001.0001.000 si-P65-1組（2）30.290±0.0170.479±0.0300.568±0.102 si-P65-2組（3）30.266±0.0350.376±0.0660.522±0.100 F值681.300128.80020.470 P值0.0000.0000.002

表3 不同siRNA轉染組U87細胞P65、p-P65和PDL1相對表達量的兩兩比較Table 3.Pairwise comparison of the relative expression of P65,p-P65 and PDL1 among groups transfected with different siRNA

討 論

膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤惡性程度高、預后差，許多針對膠質母細胞瘤的靶向藥物均未能有效延長患者的中位生存期，獨特的免疫抑制微環境發揮重要作用。膠質母細胞瘤細胞表達的免疫檢查點PDL1通過與腫瘤微環境中T淋巴細胞表達的PD1結合，誘導T淋巴細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞免疫逃逸。此外，膠質母細胞瘤還通過調節白細胞介素-10（IL-10）信號轉導通路以促進正常單核細胞的PDL1表達［14-15］。本研究對來自TCGA和CGGA數據庫的膠質瘤患者進行生物信息學分析，發現PDL1 mRNA表達量隨膠質瘤病理分級的升高而呈上升趨勢，且高表達組生存率和總生存期均低于低表達組。免疫檢查點PDL1在膠質瘤免疫抑制微環境中發揮重要作用，本研究進一步通過實驗證明，ACT001通過降低膠質母細胞瘤細胞PDL1的表達，以改善腫瘤免疫抑制微環境。

NF-κB作為轉錄因子，通過直接調控下游基因的表達或與其他信號轉導通路的交聯作用，在腫瘤的發生發展過程中發揮極其重要的作用［16］。NF-κB轉錄因子家族包括NF-κB1（P50）、NF-κB2（P52）、RelA（P65）、RelB和cRel，且這些亞基之間可以形成多種同二聚體和異二聚體，其中P50/P65是最常見的二聚體。多數情況下，P50/P65二聚體通過與胞質 中 核 因 子-κB抑 制 蛋 白（IκB）抑 制 因 子 家 族（IκBα、IκBβ和IκBε）中的任一結合，而被錨定在胞質中以無活性狀態存在；多種刺激如細菌脂多糖（LPS）或腫瘤壞死因子 α（TNF-α），使IκB激酶激活致IκB的絲氨酸磷酸化，引起IκB降解，繼而導致P50/P65二聚體磷酸化并移位入核，再與特定基因的啟動子區結合，參與其轉錄調控。激活的NF-κB信號轉導通路在膠質瘤的進展、遷移、多藥耐藥以及腫瘤相關免疫逃逸中發揮極其重要的作用［17］。NF-κB信號轉導通路還通過與其他信號轉導通路如STAT3、Notch和P53信號轉導通路的交聯作用，間接影響腫瘤進展［16，18］。本研究生物信息學分析亦顯示，P65 mRNA表達量隨膠質瘤病理分級的升高而呈上升趨勢，且其發揮活性的是磷酸化形式即p-P65；Western blotting法顯示，不同siRNA轉染組U87細胞P65、p-P65和PDL1相對表達量差異有統計學意義，其中，si-P65-1組和si-P65-2組P65、p-P65和PDL1相對表達量均低于si-NC組，表明減少U87細胞P65磷酸化水平，可以抑制PDL1的表達。

ACT001作為一種新型抗腫瘤藥物，業已完成中國和澳大利亞的膠質瘤Ⅰ期臨床試驗。目前由天津醫科大學總醫院牽頭，正在天津醫科大學總醫院、中國醫學科學院北京協和醫院、首都醫科大學附屬北京天壇醫院等7所醫院開展ACT001單藥以及ACT001聯合替莫唑胺治療復發膠質母細胞瘤的Ⅱ期臨床試驗。本研究為一項體外實驗，細胞增殖活性檢測顯示，經不同藥物濃度ACT001（5、10、20、40、80、160和320μmol/L）處理后，U87細胞抑制率分別為（9.01±4.75）%、（17.03±2.91）%、（28.50±4.85）%、（45.50±5.15）%、（67.67±8.46）%、（83.02±5.79）%和（94.33±1.59）%，從而得出ACT001對U87細胞的半數抑制濃度為42.98μmol/L。免疫熒光染色顯示，經50μmol/L ACT001處理的U87細胞P65蛋白入核減少，表明ACT001通過減少P65蛋白入核以抑制NF-κB信號轉導通路活性。Western blotting法顯示，不同濃度藥物處理組U87細胞p-P65和PDL1相對表達量差異有統計學意義，其中，ACT001 25μmol/L組和50μmol/L組p-P65和PDL1相對表達量低于正常對照組，ACT001 50μmol/L組p-P65和PDL1相對表達量亦低于25μmol/L組，表明ACT001不僅可以抑制膠質瘤細胞的增殖，還可以通過抑制P65的磷酸化及核轉位，從而抑制PDL1的表達，以改善膠質瘤的免疫抑制微環境。我們課題組的前期研究顯示，ACT001可以抑制STAT3的磷酸化［19-20］。提示ACT001可以作為一種多靶點藥物治療膠質母細胞瘤，從而為ACT001最終應用于臨床提供理論依據。

Lim等［12］和Liu等［13］針對乳腺癌和結腸癌的研究顯示，NF-κB（P65）作為轉錄因子，通過結合Cops5基因啟動子，調控COP9信號小體5（CSN5）的表達。CSN5控制約1/5的蛋白質降解過程，通過從Cullin RING E3泛素連接酶（CRLs）骨架移除激活蛋白NEDD8，使 其 失 去 活 性［21］。Lim等［12］業 已 證 實CSN5可以調控PDL1的去泛素化，減少其降解。因此，ACT001是否通過抑制膠質母細胞瘤細胞P65的磷酸化，降低CSN5表達量，從而增加PDL1的泛素降解，將是我們進一步的研究方向。

本研究通過體外實驗證實，ACT001可以抑制P65的磷酸化，下調膠質母細胞瘤細胞PDL1的表達，從而改善腫瘤免疫抑制微環境。后續將建立GL261腦膠質瘤細胞C57BL/6小鼠顱內原位種植模型，驗證ACT001對P65、CSN5和PDL1表達的調控。

利益沖突無