定量有害結局路徑(qAOPs)評估環境化學物質毒性的研究進展Ⅰ：模型構建與應用案例

彭穎，張瀚心，張效偉

1. 流域環境生態工程研發中心，北京師范大學自然科學高等研究院，珠海 519087 2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 3. 生態環境部固體廢物與化學品管理技術中心化學品部，北京100029

全球化學工業的快速發展導致化學品潛在的環境和健康風險不斷增加，這對化學品的風險管理提出更高要求。據聯合國環境規劃署(UN Environment Programme, UNEP)《全球化學品展望Ⅱ》(GlobalChemicalsOutlookⅡ)的最新數據，2017年全球包括藥品在內的化學品銷售額合計達到5.68萬億美元，預計2017—2030年期間銷售額將翻一番，中國將占全球銷售額的近50%[1]。2018年全球商業流通中的工業化學品約4～6萬種[2]，歐洲現有的注冊商業化學物質清單下使用的化學品約有14萬種[3]，美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)《有毒物質控制法清單》[4]上列出的化學品有8.5萬種，我國《中國現有化學物質名錄》統計的現有化學物質約4.5萬種[5]。與此同時，新化學物質數量逐年遞增，化學品潛在風險仍然不斷增加。傳統的化學品毒性測試如依靠動物實驗的體內毒性測試方法周期長、成本高，已不能滿足現階段化學品風險評估的需求，亟需更經濟有效、具有物種特異性與基于毒性機制的毒性測試方法，如人類體外檢測方法和其他新興技術[6]。2007年，美國國家研究委員會(National Research Council, NRC)發表報告《21世紀毒性測試：愿景與策略》(ToxicityTestinginthe21stCentury:AVisionandaStrategy, TT21C)，概述了21世紀毒性測試的未來方向和發展戰略，提出將由以動物個體為基礎的毒性測試體系轉為基于人體細胞為主的體外測試體系，關注化學物質與特定分子靶點間相互作用探究化學品對生物學基本過程影響的“毒性通路”，從而預測化學品對生物的影響、評估化學品的安全[7]。歐盟委員會科學委員會(European Commission Scientific Committee)發表的指導文件《應對風險評估的新挑戰》(AddressingtheNewChallengesforRiskAssessment)，強調了利用分子和細胞生物學過程的數據進行風險評估的優勢和挑戰[8]，但還缺乏統一的將分子水平的毒性測試方法納入到生態或人類健康風險評估中的方法[9]。

1 AOP框架概述(Overview of AOP framework)

在上述背景和基礎上，2010年，Ankley等[10]提出了有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的概念框架。一個AOP代表了化學物質干擾下各種生物水平上的聯系，化學物質進入生物體內，首先和特定靶向分子發生相互作用，即激活分子啟動事件(molecular initiating event, MIE)，進而通過關鍵事件(key event, KE)等誘導生理變化，最終導致與風險評估相關的有害結局(adverse outcome, AO)。AOP基于化學品的性質，從系統生物學的角度概括了化學品所誘導的分子水平響應，以及在該分子響應水平上細胞、組織和器官的毒性效應，進而推導出在個體、種群上的有害結局。近10年來，AOP框架逐漸發展成熟，被認為是將生物信息組織成一種可用于評估化學品對人體健康和生態環境生物毒性的新方法，其開發的目的是用于化學品的評估和監管工作，包括優先級評估和危害性預測，最終實現風險評估并應用于管理決策。

1.1 AOP數據庫(AOP Knowledge Base, AOP-KB)

2012年經濟合作與發展組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)在本身已有的數據和準則的基礎上開始發展AOP項目，用于指導化學品及其他潛在毒害物質的毒性測試。2014年，AOP數據庫(AOP Knowledge Base, AOP-KB) (https://aopkb.oecd.org/index.html)發布，該數據庫由OECD、US EPA、歐洲委員會聯合研究中心(European Commission’s Joint Research Centre, JRC)、美國陸軍研究工程師研究和發展中心(Engineer Research and Development Center, ERDC)共同參與研發。

AOP-KB包括不同的模塊，是一個不斷發展和改進的網絡平臺工具，旨在將關于化學品如何引起有害結局的所有知識集合在一起，為AOP的開發和傳播提供服務，圖1為AOP的開發的全過程示意圖(http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)。AOP-KB的主要構成包括AOP門戶(AOP potrol, https://aopkb.oecd.org/search.ashx)、AOP維基百科(AOP wiki, https://aopwiki.org/)和圖形界面Effectopedia(https://www.effectopedia.org/)等。另外，AOP Xpolorer、AOP-DB和Intermediate Effects DB等第三方模塊正在開發。截至2020年12月共有367個AOPs被提交到AOP wiki(其中有36個處于OECD審查、批準或認可的狀態)。

圖1 有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)開發的全過程示意圖 (http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)Fig. 1 Representation of the adverse outcome pathway (AOP) development process (Source from: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)

1.2 定性AOPs與定量AOPs

定性AOPs(qualitative AOPs)系統地構建了化學物質與受體、酶或其他生物分子間的相互作用(分子啟動事件)到有害結局的關鍵事件關聯的知識，從而使其能用于危害評估[11]。盡管定性AOPs適用于危害評估，但從固有的描述性AOP中并不能直接推斷出化學品的潛在風險，難以提供準確的風險評估。因此，亟需擴展AOP框架以預測可能在個體和種群水平上導致有害結局的化學劑量或濃度[12-13]。這種擴展需要對分子啟動事件、關鍵事件和有害結局之間的關系進行詳細的定量描述[14]。定量AOPs(quantitative AOPs, qAOPs)由一個或多個基于生物學的計算模型組成，模型描述了分子啟動事件與有害結局之間的關鍵事件的關聯，并提供定量的劑量-響應和時間-響應信息，能為毒害污染物的健康和生態風險管控提供有效的決策依據[11]。

定性和定量AOPs都可以通過識別、構建和整合現有的化學危害證據，用于風險表征(圖2)。然而風險表征需要劑量-響應評估與暴露評估相結合，只有qAOPs能將暴露與導致AOP中起始點(point of departure, POD)所需的化學物質的量聯系起來。當有足夠的定量信息可描述劑量-響應和/或響應-響應分子發起的事件之間的關系、關鍵事件和有害結局時，通過qAOPs可以確定導致劑量-效應評估中產生有害結局所需的外部劑量。qAOPs作為一種預測計算模型，通過了解上游KE的擾動程度預測下游AO的發生情況。OECD在開發基于綜合測試與評估方法(integrated approaches to testing and assessment, IATA)中使用AOPs的指南中指出，qAOPs可以幫助研究者以KE為目標，并為測試指南的開發或修改選擇適當的測定方法來預測AO。因此，qAOPs的發展對AOP框架應用于化學品風險管控至關重要。本文第2節將重點介紹qAOPs構建的基本框架、方法模型、研究案例及應用。

圖2 化學品危害與風險評估中的定性與定量有害結局路徑[11]注：定量的AOPs(qAOPs)是由定性的AOPs發展而來的，但對關鍵事件(KE)關系(KERs)有定量的描述符(f(x))； 定性AOPs與qAOPs均可用于危害與風險評估，f(x)代表一個數值或者統計函數。Fig. 2 Qualitative AOPs and quantitative AOPs (qAOPs) models in chemical hazard and risk assessment [11]Note: quantitative AOPs (qAOPs) are developed from qualitative AOPs but have quantitative descriptors (f(x)) for key event (KE) relationships (KERs); both qualitative AOPs and qAOPs can be used in hazard identification and assessment, in which f(x) may represent a mathematical or statistical function; MIE stands for molecular initiating event.

2 定量AOPs的研究進展(Research advance of quantitative AOPs)

21世紀毒理學的目標是在利用更少的資源(時間、金錢和動物)的同時，在更大范圍內實現對化學品風險的評估。為實現該目標，關鍵是要具備準確預測未經檢測化學品對生物個體、或種群水平的潛在危害的能力，可利用來自計算模型、體外測試或具有特定效應終點的個體短期測試，快速評估化學品與生物系統間的相互作用。AOP框架則以一種因果關聯的方式將對化學物質的活性評估轉換成與風險評估相關的響應。在對AO進行定量預測的背景下，qAOPs是這一過程自然演變的產物，從理論上講，不需要任何長期的動物試驗就可以實現化學物質的風險評估。Perkins等[11]認為qAOPs可用于2類主要問題：(1)理解和評估新的、未經測試的化學品對特定物種的風險；(2)了解和評估某一特定(組)化學品對未經檢驗的新物種的風險。

2.1 qAOPs構建的基本框架與步驟

目前國際上尚無構建qAOPs的標準化流程和方法，但歐洲食品安全局(European Food Safety Authority)用于化學品生態風險評估的機制效應模型的評估框架(transparent and comprehensive ecological modeling documentation, TRACE)為qAOPs建模提供示范和指導，主要包括模型驗證、敏感性分析、驗證和不確定性分析等主要步驟。在TRACE框架的基礎上，Perkins等[11]提出了qAOPs建模的基本步驟，包括(1)定義問題；(2)使用建模方法組裝概念模型，并將其轉換為計算代碼；(3)數據裝配和模型參數化；(4)模型測試，包括敏感性和不確定性分析；(5)最后利用該模型支持管理決策。

構建qAOP模型首先明確其將要解決的問題。qAOP模型所需的結構、細節程度和可信度在很大程度上取決于需要解決的具體問題以及與決策相關的內容[15]，比如將采取何種監管行動或作出何種決定，或保護哪些目標。因此，開發qAOP模型的第一步是確定研究需要解決的目標問題是什么，預估所需的生物學精確度水平，并評估是否有足夠多的信息來進行建模。

完整的qAOP模型從數學上描述了關鍵事件之間的聯系，將MIE激活的劑量-響應與KER的響應-響應動力學以及有害結局的表現聯系起來。qAOP模型的原始結構(MIE、KE與KER等)可以基于科學證據從頭構建，也可以從AOP數據庫中的定性AOP中獲得，其可提供較為完整的生物學和毒理學信息，而不需要額外收集新的數據。本綜述中討論的qAOP構建案例是基于AOP數據庫開發得到的。

在qAOP模型的開發中，最重要的是保證合適數據的可用性，需要MIE、KE和AO的定量數據對KER進行建模和參數化。AOP數據庫、US EPA開發的綜合計算毒理學在線資源庫(aggregated computational toxicology resource, ACToR)等可提供qAOP建模所需要的基本信息[16]。值得注意的是，開發描述多個KER的高精度模型需要詳細的濃度/劑量-響應和響應-響應間關系的數據[11]，理想情況下至少需要5組以建立劑量/響應-響應關系。若構建的目標模型的重點是與時間變化相關的事件，則用于時間序列分析的統計/建模方法至少需要10個時間點。若開發非模式物種或瀕危物種的qAOP模型，則需要從模式物種與相關物種的理論關系推斷、量化特定目標物種的qAOP模型。

模型測試也是模型構建的重要步驟，包括模型的敏感性和不確定性分析。Perkins等[11]指出敏感性分析需要測試定量模型是否充分描述了MIE、KE和AO之間的關系，可使用建模以外的其他化學物質或獨立數據進行驗證。不確定性分析需要通過與實驗數據進行比較，計算偏差，識別數據的差異，將參數和結構的不確定性納入預測中，判斷置信度是否足夠。

2.2 qAOP模型的構建方法

qAOP模型可以為危害和風險評估提供從描述性知識到預測有害結局的橋梁，從描述性AOP到qAOP的變化標志著響應-響應關系的生物學或動力學在統計上的描述，或者在KER中通過一個數學方程進行統計描述。AOP模型可以使用不同層級的KER參數規范，從等級權重到具有函數關系(包括概率關系)，再到具體相鄰的關鍵事件如何交互作用的整個模型。根據已有數據的可用性以及對KER機制的了解程度，可以選擇使用不同的方法構建qAOP模型，目前常用的數學統計模型包括以下幾種[11]。

(1)貝葉斯網絡模型(Bayesian network models)：構建的響應-響應關系可以從簡單的二進制關系(激活與不激活)到多種級別(效力等級)[17-18]。該模型可用于包含多個相互作用AOPs的大型網絡模型的開發，根據網絡中其他KE的狀態來預測下游公共KE或AO發生的可能性。

(2)回歸模型(regression models)：是一類用于評估可測量的變量之間關系的統計模型，在AOP上下游中，用于預測的變量可以是特定KE的測量值，可用來預測下游KE或AO。構建回歸模型的數據要求來自于響應-響應關系范圍內、從同一實驗中收集的至少2個不同KEA的測量值[11]。

(3)常微分方程模型(ordinary differential equation models, ODEs)：當需要構建的qAOPs的關鍵事件之間的關系涉及到時間維度，則可以選擇使用常微分方程模型方法進行構建。該qAOP模型可以應用于生物組織的任何水平，從生物分子相互作用，如類固醇生成和信號轉導[19-20]，到細胞動力學，如T細胞增殖[21]；到種群動力學，如生態建模[22]。

(4)基于個體的模型(individual or agent based models, IBMs)：基于個體的模型可以追蹤個體隨時間變化的行為，通過匯集描述種群的關鍵統計指標，如生存、繁殖和運動等[23]，對象可以是分子、組織中的細胞和群體中的個體[11]。

(5)動態能量平衡模型(dynamic energy budget models, DEB)：DEB將生物體視為一個將能量和質量吸收到體內的系統，并描述了這些能量和質量是如何用于維持或執行各種生理功能。DEB模型是基于常微分方程(ODEs)描述隨時間變化的生長、繁殖和維持等生理功能，以及環境壓力的潛在影響[24-25]，它適用于不同生活史的物種。qAOP和DEB模型之間的交互比對將提高qAOP模型的預測能力，并將KE置于一個框架中，該框架將通過將其嵌入到IBMs中來進行種群水平效應的外推[26]。

(6)種群模型(population models)：種群水平上的危害是化學物質監管和決策的最終目標。qAOP模型需要納入合適的種群模型，通過對個體生存和繁殖的影響來評估個體表現對種群動態和結構的影響[27]。種群模型有多種類型，非結構化的有序-微分方程模型如邏輯斯蒂(logistic)種群增長模型[28]、結構化種群模型如矩陣投影模型[29]和基于個體的模型[30]。

2.3 qAOPs案例及其應用

目前構建的qAOPs較少，本文基于AOP數據庫匯總了9種構建了定量關系的AOP(表1)。涉及的AO涵蓋了不同生物水平上的有害效應，包括與生物個體生長發育、生殖、皮膚致敏、肝臟損傷、神經毒性和腎臟損傷相關的毒理學終點。

其中有害結局與生態風險評估相關的qAOPs有4條(表1)。研究較為全面的是芳香化酶(aromatase)抑制導致魚類卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)酶活下降，最終導致魚類繁殖力下降的AOP(AOP ID: 25)，構建的qAOP模型涵蓋了黑頭軟口鰷不同水平的生物效應及計算模型[14]，為未經測試過的化學物質危害預測提供了示范案例[14]，并研究了該qAOP模型在其他魚類物種如日本青鳉魚(Oryziaslatipes)、斑馬魚(Daniorerio)的適用性[31]。芳香化酶抑制的qAOP中的3個模型分別如下。(1)雌性黑頭軟口鰷的下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pitutitary-gonada, HPG軸)內分泌軸模型：在芳香化酶的抑制作用下，睪酮到17β-estradiol(E2)的轉換受到抑制，導致依賴E2的卵黃蛋白的合成減少，該模型通過測定芳香化酶活性預測血漿中VTG的濃度水平。(2)依賴VTG的卵細胞生長動力學模型：描述了血漿中VTG濃度水平與卵細胞發育、產卵(繁殖力)之間的關系。(3)種群模型：應用了Miller和Ankley開發的密度相關的logistic矩陣模型[32]，通過輸入對生命率影響的估算值(例如，發生在特定年齡的繁殖力的變化)、用于構建萊斯利(Leslie)投影矩陣的生命周期表和承載力估算值，輸出與密度相關的種群軌跡。將上述3個模型耦合在一起，可對具有芳香化酶抑制作用的化學品效力(相對于陽性參考物質)進行測量，并對指定的暴露場景模擬劑量響應和時間過程。Wittwehr等[15]基于芳香化酶抑制劑參考物質法屈唑(fadrozole)構建的qAOP模型(HPG模型部分)，使用毒性當量法計算一種未經測試的化學物質異菌脲(iprodione)的效應基準值，成功預測了黑頭軟口鰷暴露于異菌脲時對血漿中E2水平的影響。同時，Conolly等[14]還利用響應-響應關系和交互參照(read-across)的方法對生態風險管控相關的毒性效應終點(魚類種群數量)進行半定量計算，預測出黑頭軟口鰷在該物質低于33 μg·L-1濃度下的持續暴露會造成20%魚類種群數量減少的危害。到目前為止，大約2 000種化學物質在ToxCast的一種核心毒素(NVS ADME hCYP19A1)體外測試中被評估為可抑制芳香化酶活性，共有168種化學物質確認為具有芳香化酶抑制效力(EC50值范圍為0.3 ng·L-1～16.3μg·L-1)，未來可進一步測試或驗證該芳香化酶抑制的qAOP對其他芳香化酶抑制劑生態毒性的預測能力，促進該qAOP在化學品的危害篩查方面的實際應用。

在對典型的二噁英及類二噁英物質(dioxins-like compounds, DLCs)通過AhR激活致毒機制了解的基礎上，Doering等[33-35]針對DLCs構建了AhR激活(MIE)導致鳥類和魚類生命早期階段死亡(AO)的qAOP(AOP ID: 21)。并根據已發表文獻中DLCs暴露濃度和胚胎死亡率的實際劑量-響應曲線構建了MIE與目標AO間的定量關系，還評估了基于體外AhR活性測試對鳥類和魚類生命早期階段死亡的預測能力，qAOP的預測結果與標準的胚胎毒性測試結果的平均差異為2.2。盡管現有研究表明該qAOP可拓展至不同的生物物種，但該qAOP對其他潛在的DLCs的危害識別能力還需要進一步研究。

另外2個最新開發的qAOP分別是光合磷酸化解耦聯劑(DCP)抑制水生植物浮萍(Lemnaminor)[36]生長(AOP ID: 245)和納米銀顆粒通過氧化應激誘導秀麗隱桿線蟲的生殖毒性[37](AOP ID: 207)，兩者均使用了貝葉斯網絡模型構建MIE、KE與AO之間的定量關系，但兩者均屬于初步構建階段，模型的驗證和不確定性分析還需要進一步的研究。

與人體健康風險評估相關的qAOP有5條(表1)。其中皮膚致敏是個人護理品安全性評估的一個重要毒理學指標。Jaworska等[17]和Pirone等[38]使用貝葉斯網絡分析方法，通過整合體外試驗和計算模型的事件測量值，來評估一種化學物質導致皮膚敏化的效力，可用于篩選可能導致皮膚敏化的化學物質。OECD建立的皮膚致敏AOP框架也是首個成功應用于法規的案例。基于該AOP框架的直接多肽結合測試、抗氧化反應轉錄元件-核因子E2相關因子(ARE-Nrf2)熒光素酶檢測法和人類細胞系活化測試被化學品注冊、評估、許可和限制(Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals, REACH)法規納入認可的皮膚致敏檢測方法范疇。

表1 基于AOP數據庫構建的qAOPs及其應用Table 1 Developed qAOPs based on AOP wiki and its application

Burgoon等[39]通過貝葉斯網絡方法構建了脂肪酸氧化抑制導致脂肪變性的qAOP(AOP ID: 213)，被用來預測化學混合物的危害。該研究使用了過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ, PPAR-γ)完全激動劑(藥物羅格列酮)和部分PPAR-γ激動劑、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)完全激動劑全氟類有機污染物(perfluorooctanoic acid, POFA)為對象，通過qAOP預測的兩者共同作用導致脂肪變性的概率與羅格列酮對肥胖患者影響的臨床研究中的結果一致[40]，也與高脂飲食聯合羅格列酮喂養小鼠的脂肪變性的結果一致[41]。該研究為解決化學混合物的危害評估提供了很好的示范。AOP貝葉斯網絡模型能夠對化學混合物通過相同與不同的MIE而導致的潛在危害進行有效的預測，可用于化學品和化學混合物的危害篩查與化學物質優先排序研究。

Zgheib等[42]以簡化的氧化應激誘導的慢性腎臟疾病qAOP(AOP ID: 284)為例，根據RPTEC/TERT1細胞暴露于溴酸鉀獲得的體外數據，比較了3種構建qAOP方法的優劣(基于經驗數據的劑量-反應模型、貝葉斯網絡模型和系統生物學模型)，建議至少采取2種建模方法同時進行研究，以避開qAOP開發過程中的陷阱。

在已有AOP“谷氨酸激動劑與成人大腦中的離子性谷氨酸受體結合導致興奮性毒性，導致神經元細胞死亡，最終導致學習和記憶障礙”[43](AOP ID: 48)的基礎上，Foran等[44]通過一種模塊化組裝的方法簡單快速地構建了用于評估人暴露于軟骨藻酸后導致的潛在記憶損失的qAOP，該方法要求表征每個KER間的響應-響應關系函數。相比其他方法，該方法在發展KE之間的響應-響應關系方面需要的時間和數據更少，但模型的不確定性更高，較為適合化學品危害的初級篩查階段。

Hassan等[45]在嚙齒類動物模型中構建了根據經驗推導的qAOP。該qAOP以大腦神經元皮質異位(甲狀腺依賴的神經發育毒性)為AO，通過試驗得到的數據對甲狀腺AOP(AOP ID: 42)中的幾個KE(甲狀腺過氧化物酶抑制、甲狀腺素合成障礙、血清和腦甲狀腺素缺陷和子代大腦結構畸形)進行定量描述，預測了血清中甲狀腺素(thyroxine, T4)的變化，評估甲狀腺干擾物對大腦發育的潛在影響。但是該qAOP目前僅適用于甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase, TPO)抑制劑的模式化學物質丙基硫氧嘧啶(6-propyl-2-sulfanylidene-1H-pyrimidin-4-one, PTU)，最近用于篩選1 074種體外抑制TPO的外源性藥物，其中超過300種化學物質在體外被確定為TPO抑制劑，后期需要進一步確定該定量關系的程度和分析預測模型的不確定性，未來可用于評估其他潛在甲狀腺抑制劑的危害。

3 總結與展望(Conclusions and perspectives)

3.1 qAOPs發展中的問題

雖然上述的研究案例展現了qAOPs在化學物質危害預測與風險管理方面的應用潛力，如預測單一化學物質導致的與風險評估監管有關的危害、外推至未經測試的化學物質和其他物種、化學品優先排序與篩查等，但是大部分qAOPs的開發處于模型構建的初步階段，仍存在一些亟需解決的問題。

(1)已構建的qAOP模型預測能力的可信度亟需提高，需要進一步的驗證、優化與完善，包括加大對潛在毒害化學物質、本土物種(或實際管理中所關心的特定物種)的適用性研究、不確定性的定量分析等工作，才能促進它們在化學物質的風險評估與管理決策方面的應用。qAOPs對其他潛在毒害化學物質的預測能力的提升，可通過開發和選擇合適的體外測試方法測量生物學效應，為化學適用性研究提供足夠的實驗數據。另外可通過對模式物種與特定目標物種(本土物種或瀕危物種)間特定劑量-效應關系中參數(如受體的激活與結合的親和力)的研究，拓展qAOPs對其他生態物種的適用性研究[14]。

(2)qAOP模型的完善和新qAOPs的開發受到毒性機制信息及相關數據嚴重缺乏的限制。qAOPs的各個關鍵要素的識別與驗證，均需要投入大量的時間、精力等資源才能獲得。其中包括分子水平上的MIE、KE，中間多個KE間的關聯信息，以及個體或種群水平的AO等信息。針對這一問題，有研究人員建議未來qAOPs的開發工作可優先考慮現階段已有完整信息的定性AOP[14]。

(3)化學物質致毒機制信息缺乏中，最關鍵的問題是大多數化學物質的MIE仍然未知，這嚴重限制了AOPs在化學物質風險評估中的應用。解決這一問題可通過組學方法了解生物學通路的結構，促進識別分子水平變化。組學技術如轉錄組學、代謝組學、脂質組學與蛋白質組學能在單個樣本中評估數萬個基因及其產物的反應，提供測得的基因、蛋白質和/或代謝物的高含量數據集[46]，結合計算生物學的方法將這些數據集納入AOPs的分析和應用中，能幫助識別和理解MIE和早期KE[47]。在AOP框架下利用組學數據識別新的MIE與KE、理解其如何導致AO，并提供定量信息，這將會極大促進qAOPs的發展。

(4)現有qAOPs尚未考慮到化學物質的暴露過程，獲得生物體內靶位點(target site)的化學暴露濃度對于使用qAOP模型準確預測有害效應/結局的程度是至關重要的[48]。體內和體外的毒代動力學的不確定性和差異是重要的參數，如暴露條件、生物可利用性、吸附、分布、代謝或排泄等，將會影響通過外暴露濃度的預測危害的結果[11]。

(5)現有qAOPs的模型構建步驟與方法還未形成統一的標準和規范。在發展過程中使用規范的建模方法，將模型預測的結果和對解決化學品監管問題的能力進行測試和記錄，能夠有效并及時了解qAOP模型存在的問題，幫助提高預測的可靠性。

3.2 未來展望

AOPs不僅僅是一種能識別出有毒化學物質的潛在健康風險的工具，也會為化學物質的健康與環境風險管控提供重要支持。除了應用于單一化學物質的危害預測外，針對真實環境中混合暴露的生態健康風險評估難題[49-51]，未來可探索基于qAOPs預測化學混合物暴露導致的生態危害。隨著qAOPs與AOP網絡(AOP network)的進一步發展和完善，還可采用基于生物效應的測試方法(effect-based methods, EBMs)[52]與AOP網絡分析相結合的方法，評估環境混合物暴露導致的生態危害，如根據水質保護目標確定生物類群、敏感物種(優先關注物種)及可能發生的有害結局(毒性類型、毒性終點)，然后根據優先關注的敏感生態物種的有害結局，確定關鍵的目標AOP，再選擇相應的生物測試方法，進而對復合水環境中的毒害物質進行風險評價與管理[53]。

將qAOPs拓展到更高層次的生物組織，可促進對環境影響的實地評估和診斷，有助于實現對個體、種群和群落水平危害預測的生態風險評估。如結合環境DNA(environmental DNA)技術對水生態群落進行生物多樣性監測，構建生物多樣性-生態系統模型，從而將有害結局從化學物質導致個體效應終點(如死亡率、發育和繁殖)擴展到對水生態系統健康評價和管理更重要的效應終點(生物多樣性和生態系統功能)。將當前AOP框架的概念擴展到群落和生態系統，可促進對化學物質毒作用機制和非化學脅迫因子評估的研究[54]。

盡管目前只有較少的qAOPs應用于化學品風險評估與管理的案例，隨著更多qAOPs的構建與進一步完善，它在化學品風險評估領域上將得到更廣泛的應用。建議參考Patlewicz等[47]提出的支持AOP應用于化學品管控的科學框架，探索利用現有成熟qAOPs應用于不同層次的化學品監管。例如將qAOPs應用于化學品風險評估的初級階段(化學品分類與優先級評估)，可獲得更多的實驗數據進一步優化qAOP模型，為未來AOP的實際應用提供科學依據和經驗。