微/納米塑料對淡水生物毒性、機理及其影響因素研究進展

張帆，王壯

南京信息工程大學環境科學與工程學院，南京 210044

隨著現代人類社會的發展，人們在生產和生活中正過度地使用各種塑料材料，并以每年上百萬噸的數量向海洋環境排放著塑料垃圾[1]。目前，塑料污染已成為全球亟需解決的環境問題[2]。微塑料為顆粒直徑在5 mm以下的小顆粒塑料碎片[3]，當顆粒直徑處在1～100 nm范圍，可將微塑料稱為納米塑料[4]，其在全球水環境均有檢出及分布[5]，并已成為塑料污染的首要污染物。微/納米塑料(MNPs)具有粒徑小、比表面積大、疏水性強和難降解等物理化學特性[6]，這也引起人們對MNPs的人類健康[7]和生態環境[8]風險的關注。近年來，國際上發表了大量有關MNPs生態毒性的研究論文，其中，考察MNPs對海洋環境物種的毒理效應的居多，而考察MNPs對淡水生態系統中生物的毒性研究起步較晚，可能與前期MNPs污染調查主要集中在海洋環境有關。此外，MNPs可通過多種途徑進入到淡水環境中[9-10]，使得從微生物(如細菌和部分藻類)到更復雜的生物體(如水生脊椎動物)有機會暴露于MNPs。因此，建立MNPs生態風險評估程序對解決塑料污染問題具有十分重要的意義。

藻類、水溞和魚類是淡水生態系統的重要組成部分，構成了淡水生態系統中由不同營養級生物所形成的食物鏈，也是污染物進行標準化測試(如ISO、OECD、US EPA)所經常選取的物種。本文整理和總結MNPs對藻類、水溞和魚類毒理效應的研究進展，并闡釋MNPs對淡水生物毒性的作用機理，著重分析影響MNPs對淡水生物毒性的主要因素，最后指出塑料生態毒理學今后的研究趨勢。

1 MNPs對淡水生物的毒理效應(Toxicological effects of MNPs to freshwater organisms)

釋放到水環境中的MNPs可經歷多種遷移(如沉降[11]等)和轉化(如物理化學作用[12]等)過程，將以多種形式對水生生物造成潛在的危害。為了實現MNPs生態風險管理，需要評價不同種類、性質及形式MNPs對水生生物的生態毒理效應。遵循van Leeuwen等[13]概述的框架，我們進一步對MNPs為代表的塑料污染物生態風險評估程序進行補充，主要包括9個程序(圖1)：生態危害識別、暴露評估、物理化學性質表征、效應評估、風險表征、風險分類、風險效益分析、風險削減以及監測和審查。在各個評估過程中，MNPs生態毒理學數據可作為其生態風險評估的依據。

圖1 微/納米塑料(MNPs)的生態風險評估程序Fig. 1 Programme of ecological risk assessment of micro/nano plastics (MNPs)

1.1 MNPs對藻類的毒性

藻類因個體小、繁殖快、對毒物敏感，是評價水生系統中MNPs潛在毒性的常用模式生物[14]。目前，關于MNPs對淡水藻類表觀毒性作用的研究，主要涉及以下2個方面的內容。

(1)考察MNPs對藻類生長抑制毒性。少量研究表明，MNPs對淡水藻類產生了生長抑制毒性[15-16]，例如55 nm和110 nm聚乙烯亞胺-聚苯乙烯MNPs對羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的72 h生長抑制毒性的50%效應濃度(EC50)值分別為0.58 mg·L-1和0.54 mg·L-1[15]。然而，大部分研究發現，MNPs對淡水藻類的生長沒有顯著影響，這可能是由于細胞壁的存在限制了MNPs侵入藻細胞中。

(2)考察MNPs對藻類光合活性的抑制。Bhattacharya等[17]發現，20 nm聚苯乙烯MNPs降低了小球藻(Chlorellasp.)的光合活性；類似地，Mao等[18]發現，100 nm和1 μm聚苯乙烯MNPs降低了蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的光合活性。值得指出的是，藻類光合活性的降低可能與光合成基因表達的下降有關[19]。

綜上可見，不同毒性指標反映出藻類對MNPs敏感性不同。因此，篩選敏感的毒性指標來評估MNPs對淡水藻類毒性仍是本領域重要的研究內容之一。

1.2 MNPs對水溞的毒性

在生態毒理學研究中，水溞也是最常用的非靶標受試生物之一。為了全面評估MNPs生態風險，考察其對水溞的毒理效應是必不可少的一環。目前針對MNPs水溞毒性的研究主要集中于以下3個方面。

(1)急性毒性作用。Eltemsah和B?hn[20]研究發現，聚苯乙烯MNPs(6 μm)暴露48 h后對大型溞(Daphniamagna)無急性毒性，但暴露120 h后引起水溞致死；Rehse等[21]發現1 μm聚乙烯MNPs暴露96 h對大型溞產生急性毒性，并確定了96 h-EC50值為57.43 mg·L-1；Liu等[22]研究發現，聚苯乙烯MNPs(75 nm)對蚤狀溞(Daphniapulex)的48 h 50%致死濃度(LC50)值為76.69 mg·L-1。

(2)慢性毒性作用。據報道，MNPs對水溞存在明顯的慢性毒性[16,22-23]。例如，Cui等[23]發現，聚苯乙烯MNPs(52 nm)抑制了盔形溞(Daphniagaleata)的繁殖并誘導其胚胎發育異常。Zhang等[24]認為，聚苯乙烯MNPs(75 nm)誘導蚤狀溞生長緩慢、生殖能力減弱及生殖方式改變(由無性向有性轉變)。Bosker等[25]的研究表明，在暴露于1～5 μm MNPs 29 d后，大型溞的種群數量明顯減少。

(3)吸收與生物富集。大型溞對聚苯乙烯MNPs(6 μm)在20 顆粒·mL-1和2 000 顆粒·mL-1的濃度下生物富集因子分別為0.034±0.005和0.026±0.006[26]。Scherer等[27]的研究表明，大型溞以濃度依賴的方式攝入聚苯乙烯MNPs，攝入量達到6 180 顆粒·h-1，在所研究的水生生物中最高。此外，Chae等[28]通過實驗研究認為，MNPs(51 nm)能夠富集在大型溞的腸道內，并可從大型溞轉移到較高營養級的中華青鳉(Oryziassinensis)中，說明MNPs可沿食物鏈向更高營養級轉移，但是否存在生物放大作用還有待進一步研究。

1.3 MNPs對魚類的毒性

魚類是水生食物鏈中最頂端的生物，同時具有較高的生態和經濟價值，被廣泛用于污染物的生態風險評價。因此，有關MNPs對淡水魚類毒理學效應的研究備受關注，主要集中在考察MNPs對魚類早期發育階段生理特征的影響及生物分布和富集。例如，Malafaia等[29]觀察到，低濃度的聚乙烯MNPs(38.26 μm±15.64 μm)對斑馬魚(Daniorerio)胚胎和幼魚有危害效應，并對胚胎的孵化率產生負面效應，同時引起了魚體不同形態指標的顯著變化。Lei等[30]揭示了5種不同類型MNPs(～70 μm)對斑馬魚腸道產生損傷，包括絨毛破裂和腸細胞分裂。Parenti等[31]還發現，斑馬魚胚胎可攝入0.5 μm聚苯乙烯MNPs，且顆粒可富集在魚體的消化道，并可通過腸上皮遷移到其他組織。Qiang和Cheng[32]的研究表明，1 μm聚苯乙烯MNPs可引起斑馬魚幼魚游動距離和活動速度的降低。

此外，Ding等[33]觀察到，聚苯乙烯MNPs(100 nm)可富集在羅非魚(Oreochromisniloticus)的多個組織中，包括腸道、鰭、肝臟和頭部，其中腸道富集的量最大。Elizalde-Velázquez等[26]確定了，黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)對聚苯乙烯MNPs(6 μm)在20 顆粒·mL-1和2 000 顆粒·mL-1的濃度下生物富集因子分別為0.094±0.037和0.205±0.051，顯著高于大型溞的生物富集因子值。可見，吸收、富集和代謝作用將有助于進一步理解MNPs對魚類的毒理效應，但定量研究魚類對MNPs的吸收、富集和代謝完整過程仍有大量工作要做。

綜上，目前關于MNPs生態毒理效應的研究主要是在細胞和個體水平，如何將MNPs對細胞和個體水平效應外推到對生物種群、群落甚至整個生態系統的效應是本領域重大挑戰之一。

2 MNPs對淡水生物毒性的作用機理(Toxicity mechanism of MNPs to freshwater organisms)

MNPs對淡水生物毒理效應的研究方興未艾，然而MNPs確切的毒性作用機理尚未完全闡明。值得注意的是，MNPs對不同種類的淡水生物的毒性作用機理不同，加之MNPs對某一特定淡水生物的毒性效應并不一定通過單一機理來實現，而是通過多種機理共同作用于生物體。因此，需要開展既有深度又有廣度的機理性研究工作。MNPs對淡水藻類、水溞和魚類的主要致毒機理概述如下。

2.1 MNPs對藻類的毒性作用機理

目前針對MNPs對淡水藻類的毒理學研究還十分有限，且致毒機理研究不夠完善。現有研究結果顯示，MNPs對微藻毒性的致毒機理，主要有表面效應[17]、細胞膜毒性[34]和細胞內活性氧物種(ROS)引起的氧化應激反應[17]等。MNPs對淡水綠藻毒性，還可能存在遮蔽效應、機械損傷及遺傳毒性等作用機理，但這些致毒機理有待進一步闡明。

2.2 MNPs對水溞的毒性作用機理

水環境中MNPs較易于被水溞攝入體內，并主要富集在腸道中，而更小尺寸乃至納米級MNPs的顆粒可能會轉移到肝臟和循環系統，從而導致較強的毒理效應。MNPs對水溞產生的活動抑制主要是由于腸道的阻塞作用引起的[35]。MNPs對水溞的毒理效應不僅體現在個體水平上，在組織、細胞水平及物質代謝、合成等方面也可能產生負面的影響[36-38]。Liu等[39]研究發現，MNPs可被攝入蚤狀溞體內，高濃度水平的MNPs可影響水溞的熱休克蛋白和能量系統，隨即影響其生長和繁殖。納米尺寸的MNPs可誘導水溞體內產生過量的ROS，并激發下游路徑，最終抑制機體生長、發育及繁殖[40]。

2.3 MNPs對魚類的毒性機理

淡水中的魚類會誤食MNPs，亦可排泄MNPs[41]。腸道是MNPs主要存在的場所和進入循環系統的通道[42]。由于MNPs難降解，一旦被魚類攝入體內，其在腸道的停留時間較長，從而導致魚類攝食量下降，進而引發機體的炎癥效應，使其吸收與儲備能量的能力下降。MNPs(5 mm～100 nm)對魚的毒性作用方式與機理主要包括：消化和排泄系統損傷[30,43]，腸道炎癥[43-44]、微生物菌群失調[43]、行為、感知和神經肌肉功能失調[33,45-47]，循環和呼吸系統效應[48-49]、免疫系統效應[48,50-51]、氧化應激效應[43,52]、干擾葡萄糖代謝[53]、DNA損傷[54]及生殖損傷[55-56]。

3 MNPs對淡水生物毒性的主要影響因素(Main factors of affecting the toxicity of MNPs to freshwater organisms)

甄別MNPs淡水水生毒理效應及致毒機理的主要影響因素(圖2)，是完善MNPs生態風險評估體系的重要環節。近年來，國內外的學者分別從MNPs基本的物理化學性質、共存物質和水溶液化學條件3個方面進行了研究。其中，基本的物理化學性質(如聚合物類型、元素摻雜、尺寸、表面特征及顆粒形狀)是影響MNPs生態毒性的直接因素，而共存物質(如單體和添加劑釋放、其他污染物)與水溶液化學條件(pH、鹽度和溶解性有機質)是影響MNPs與生物體間相互作用的間接因素。

圖2 微/納米塑料對淡水生物表觀毒性和致毒機理的主要影響因素示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the main factors affecting the apparent toxicity and toxicity mechanism of micro/nano plastics

3.1 聚合物類型

聚合物(即母體結構)類型包括元素成分和化學結構，是所有物質的一種內在特征。因此，化學組成是了解MNPs生物效應的一個重要參數。MNPs有多種聚合物類型[57]，從不可降解的聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚對苯二甲酸乙二酯，到可降解的聚乳酸、聚羥基丁酸脂和聚丁二酸丁二酯。目前，研究表明，不同聚合物類型的MNPs對淡水生物產生了不同的毒性效應。例如，Lagarde等[19]的研究表明，聚丙烯對淡水藻類萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生長存在抑制作用，但高密度的聚乙烯并未產生生長抑制毒性。Renzi等[58]的研究結果表明，不同類型MNPs對大型溞的毒性大小順序依次為：聚氯乙烯(含表面活性劑)>聚乙烯(含表面活性劑)>聚丙烯(含表面活性劑)>聚乙烯。

3.2 元素摻雜

新型MNPs(尤其是金屬元素摻雜MNPs)的研究與應用日益受到關注[59]。Zhang等[60]研究發現，鐵氧化物摻雜氨基化MNPs(1 μm)在水中的穩定性高于鐵氧化物摻雜羧基化MNPs(1 μm)，且鐵氧化物摻雜氨基化MNPs對蛋白核小球藻和大型溞的急性毒性強于鐵氧化物摻雜羧基化MNPs和非摻雜MNPs。該研究還發現，鐵氧化物摻雜MNPs可部分溶解于水中，但毒性作用主要由顆粒本身所引起而非其溶解部分[60]。在低效應濃度下，藻細胞對鐵氧化物摻雜氨基化MNPs的攝取量高于鐵氧化物摻雜羧基化MNPs。此外，鐵氧化物摻雜氨基化MNPs被大量吸附在大型溞體表的觸角、甲殼和殼刺，而鐵氧化物摻雜羧基化MNPs主要被積累在大型溞消化道內部。研究還表明，鐵氧化物摻雜MNPs對蛋白核小球藻和大型溞的毒性作用機制與顆粒物誘導的氧化損傷效應無關[60]。

3.3 尺寸

尺寸大小是MNPs最顯著的特征，它在影響MNPs最終特性方面至關重要。尺寸大小也是MNPs進入生物體并產生毒理效應的關鍵因素之一。學者們普遍認識到納米塑料對淡水生物的毒理效應強于微塑料。

例如，在同等濃度(250 mg·L-1)條件下，50 nm的聚苯乙烯MNPs比0.5 μm和6 μm的聚苯乙烯MNPs降低藻細胞密度的效果更為顯著[61]。粒徑大小是影響大型溞攝入和積累MNPs的重要因素之一。Scherer等[27]發現，大型溞可攝入1 μm和10 μm聚苯乙烯MNPs，但無法攝入90 μm聚苯乙烯MNPs。Rist等[62]研究了2 μm和100 nm聚苯乙烯MNPs對大型溞攝食率的影響，發現100 nm聚苯乙烯MNPs暴露下大型溞的攝食率比2 μm聚苯乙烯MNPs暴露下大型溞的攝食率降低了21%，表明納米尺寸比微米尺寸的MNPs對大型溞的毒性作用更強。類似的，Rehse等[21]考察了2種粒徑(1 μm和100 μm)聚乙烯MNPs對大型溞的毒理效應，結果表明，大型溞可攝入1 μm聚乙烯顆粒，而無法攝入100 μm聚乙烯顆粒，且100 μm聚乙烯顆粒對大型溞無明顯毒性作用。

Yang等[63]發現，70 nm MNPs對金魚(Carassiusauratus)幼魚的毒理效應高于50 μm MNPs。尺寸越小的MNPs更易于穿越生物屏障，滲入組織并富集在器官上。同時，尺寸越小的MNPs具有越高的比表面積，提高了其反應性進而提高了顆粒的生物活性。然而，最新研究顯示，5 μm和70～90 μm MNPs在紅羅非魚體內產生的氧化應激效應比300 nm更強，意味著MNPs對紅羅非魚的毒性效應與尺寸呈負相關，可能的原因是由于攝入的生物碎片調節了MNPs的生物有效性，從而增加其毒理學潛力[64]。

3.4 表面特征

除了尺寸，表面特征也是決定MNPs毒性效應的重要因素。工程化MNPs特別是球型顆粒的表面可被功能化的官能團所修飾[65]，常見的有氨基化和羧基官能團。此外，在紫外輻射、機械磨損、水解和生物降解的作用下，不同官能團(如氨基和羧基)也可被引入到MNPs的表面[66]。一般而言，進入水環境后，表面修飾后的顆粒具有較好分散性，同時氨基化MNPs表面攜帶正電荷，而羧基化MNPs表面攜帶負電荷。目前的研究顯示，帶正電荷的MNPs比帶負電的MNPs對藻類具有較高的相互作用[67]和毒性[17]。這可能是由于帶正電荷的MNPs與藻細胞膜的磷脂雙分子層有高的親和力，有利于藻細胞通過內吞作用對MNPs進行攝取并引起毒性作用[68]。

3.5 形狀

MNPs具有多種形狀，如球狀、纖維和碎片等。研究證實，MNPs對淡水生物的毒理效應與顆粒形狀密切相關。Qiao等[69]發現，斑馬魚以形狀依賴的方式在腸道內富集聚苯乙烯MNPs(15 μm)，對3種不同形狀MNPs富集量的大小順序依次為：纖維(8.0 μg·mg-1)>碎片(1.7 μg·mg-1)>球形顆粒(0.5 μg·mg-1)。Frydkj?r等[70]采用形狀規則的聚乙烯顆粒和不規則的聚乙烯碎片作為實驗材料，對比研究這2種形狀的MNPs對大型溞的毒性效應，發現大型溞可攝入2種不同形狀的MNPs，但發現不規則的聚乙烯碎片在大型溞腸道內停留時間會更長，并且導致大型溞的活動受抑制率也更高。Ogonowski等[71]的研究也表明，形狀不規則的次級MNPs對大型溞的毒性作用比規則的初級MNPs強，且導致大型溞的死亡率也更高。

3.6 單體和添加劑釋放

一些用于合成塑料的有毒單體[72]，如氯乙烯、苯乙烯和雙酚等，在聚合過程中仍以殘留形式存在，這些殘留單體在其使用壽命內釋放到水環境中。此外，酯鍵的水解也促進了這種浸出過程。因此，伴有單體浸出的MNPs毒理學效應亦需要重視。

在塑料生產過程中，為改善塑料性能和提升其耐熱性，通常添加多種類型的添加劑[73]，包括增塑劑、抗氧化劑、阻燃劑、著色劑和填料等，這些添加劑的主要成分通常包含鄰苯二甲酸鹽、多溴聯苯醚、雙酚A和重金屬等有毒有害物質[74-75]，它們具有生殖毒性、致突變性和致癌性[76]。釋放到水環境中的MNPs，在老化、破碎過程中經過化學降解及生物降解多種作用下，經歷長時間的浸泡會導致單體和添加劑浸出[77]，進而對水生生物產生毒害作用。另外，很多研究選用帶熒光添加劑的MNPs以揭示其生物分布等特征。然而，研究結果顯示[78]，熒光添加劑隨著水溶液pH和浸出時間的增加，其浸出量也隨之增加，并可降低藻類的光合成量子產率。文獻資料所獲得的毒性數據很可能與實驗材料(塑料基質)中的“添加劑”有關，而并非聚合物本身的“各種毒性”[79]。總體而言，關于MNPs中添加劑的釋放對淡水生物毒性數據仍相對匱乏。

3.7 其他污染物

MNPs具有憎水性和較大比表面積[57,80-81]，扮演著多重載體角色[81]。當進入水環境中，MNPs會吸附共存的持久性有機污染物(如多氯聯苯[82]、多環芳烴[83]和滴滴涕[84])、藥物及個人護理品(如抗生素[85]、毒品[86])、天然有機大分子(腐殖酸[87-88])及重金屬(如Au[89]、Ni[90])等，從而產生聯合毒性。共存污染物可引起MNPs對淡水生物的毒性改變。例如，Au離子的存在加劇了聚苯乙烯MNPs(50、200和500 nm)對斑馬魚胚胎的毒性作用[89]，這與Au離子與聚苯乙烯MNPs協同產生ROS和炎癥反應有關，并造成線粒體損傷進而引起二者的協同效應。MNPs的聚合物類型、成分、粒徑大小、表面結構、老化性能以及共存污染物類型均可影響表面結合污染物的能力[91-93]，進而影響聯合毒性作用。此外，MNPs還可與工程納米粒子(如納米Ag[94])對淡水生物產生聯合毒性。近期有研究證實[95]，攜帶病原菌的MNPs可改變魚體胃腸道和肺部的微生物群落結構，最終導致炎癥反應和氧化應激。目前，MNPs與共存污染物的復合污染問題已成為領域研究的前沿熱點。

3.8 水溶液化學條件

在淡水環境中，水溶液化學條件例如pH[96]、無機離子[12,96]和溶解性有機質[96-97]對MNPs分散、團聚及毒性有一定的影響。例如，Zhang等[96]研究發現，二價陽離子(Ca2+和Mg2+)與溶解性有機質共存增加了聚苯乙烯MNPs(50～100 nm)在水中的團聚程度，這主要歸因于二價陽離子與溶解性有機質發生了吸附架橋作用，表面改性和pH是影響MNPs在水中長期穩定性的主要因素。Zhang等[96]通過毒性測試觀察到，水溶液化學條件越復雜，氨基化和羧基化MNPs(50～100 nm)對大型溞的急性毒性就越強。

3.9 其他影響因素

除了上述幾種影響因素外，實驗暴露條件(如暴露途徑[98]、時間[99]、濃度[99]及介質條件[67]等)、溫度[100]，甚至氣候變化[101]都會影響MNPs對淡水生物的毒性效應。因此，探究MNPs對淡水生物的毒性作用時，需要綜合考慮多種因素的影響。

4 結論與展望(Conclusion and prospect)

本文回顧和總結了MNPs對淡水生物(即藻類、水溞和魚類)毒理效應的研究進展，歸納了不同因素對MNPs水生生物毒性的影響，探討了MNPs對淡水生物毒性的作用機理。盡管目前關于MNPs對淡水生物毒理學方面研究取得了積極的進展，人們對MNPs毒性效應及機理也有了一定的認識，但仍需對以下問題進一步深入研究。

(1)現有針對MNPs的水生毒性測試及機理研究，大多基于高濃度顆粒的急性毒性暴露。雖然在世界各地淡水水體中MNPs檢出率較高，但其平均豐度普遍較低。因此，亟待加強低劑量MNPs長期暴露，對淡水生物早期生命階段、繁育能力和基因變異的長期多世代影響研究。

(2) 現有針對塑料生態毒性的研究，多集中選用微塑球或微塑珠的初級塑料顆粒。然而，環境中檢出的往往是廢棄塑料經過物理、化學和生物轉化后的塑料顆粒，且這些顆粒具有不規則的形狀。據報道，在我國的淡水環境中，MNPs的形態以纖維狀為主[102]。與微塑球顆粒相比，不規則形狀的塑料顆粒對淡水生物毒性研究仍十分有限，且毒性機理尚不明確。因此，下一步需加強研究不同形狀MNPs(尤其是纖維狀)對淡水水生生物的毒理效應、暴露途徑及毒性機理。

(3)對于目前的MNPs毒理學研究而言，其質量往往是給予劑量的唯一度量。然而，研究證實具有相同化學組成的MNPs可表現出完全不同的毒性作用，這與MNPs物理化學性質(如尺寸大小)密切相關。因此，其他物化性質參數(如顆粒數目、表面積等)可能更適用于表征MNPs的給予劑量。因而亟需構建MNPs的性質-毒性效應關系，比較傳統濃度-效應關系，其對豐富MNPs生態效應評估框架有重要意義。