離子液體[Bmim]Cl對HepG2細胞糖代謝的影響

周磊，薛永來，崔雯，何錦，高璐，杜道林

江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013

離子液體是指由有機陽離子和無機或有機陰離子組成的一類液體，相較于傳統(tǒng)易揮發(fā)的的有毒溶劑，離子液體具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、非揮發(fā)性、不可燃性、幾乎沒有蒸氣壓等優(yōu)點[1]，是被人們廣泛應(yīng)用于有機合成、生物催化和電化學(xué)等領(lǐng)域的“綠色溶劑”[2-4]。然而近年來研究人員用細菌、真菌、小鼠、魚類和哺乳動物細胞系等實驗?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)，離子液體存在生物毒性。

研究表明，咪唑類的離子液體會抑制魚卵巢細胞(CCO)和人體宮頸癌細胞(HeLa)的增殖且具有明顯的劑量依賴性[5-6]。值得注意的是，Ranke等[7]以白血病細胞(IPC-81)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(C6)為實驗?zāi)Ｐ停x取幾種不同鏈長的咪唑類離子液體和傳統(tǒng)的溶劑(丙酮、乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚)一起進行暴露實驗，發(fā)現(xiàn)烷基鏈越長其毒性越強，最長鏈的咪唑類離子液體，其毒性甚至超過同等濃度下的傳統(tǒng)溶劑。除了體外實驗，也有研究人員以斑馬魚、小鼠和蚯蚓等動物，以個體作為實驗?zāi)Ｐ瓦M行體內(nèi)實驗[8-10]。Dong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類的離子液體會誘導(dǎo)斑馬魚肝臟活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)過量產(chǎn)生損傷肝臟，并且會導(dǎo)致斑馬魚的DNA損傷。離子液體生殖毒性也在體內(nèi)實驗中得到驗證，經(jīng)離子液體暴露后的CD-1小鼠的生殖能力會受到影響[12]。離子液體的毒性也在植物中被驗證，Liu等[13]發(fā)現(xiàn)[C8mim]Br暴露下小麥的光合作用被明顯抑制并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

研究者也對離子液體毒性作用的機制進行了研究。Cornmell等[14]通過傅里葉紅外檢測發(fā)現(xiàn)離子液體會進入細胞并在生物膜上大量累積，在細胞質(zhì)中卻并未檢出離子液體。Hartmann等[15]研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類的離子液體會與生物膜相互作用滲透進入細胞的磷脂雙分子層中破壞其完整性，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，側(cè)鏈烷基長度的變化會顯著影響離子液體的親脂性，從而導(dǎo)致受試細胞生物膜的通透性發(fā)生變化，因此側(cè)鏈長度越長的同類離子液體表現(xiàn)出的細胞毒性越大。總之，離子液體對細胞的影響主要表現(xiàn)破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)、增加膜的通透性和降低膜電位進而誘導(dǎo)ROS過量，產(chǎn)生細胞破裂，誘導(dǎo)細胞凋亡[16]。膜電位的改變可能會引起胞內(nèi)線粒體的滲透壓發(fā)生變化，從而對能量代謝造成影響。糖代謝作為生物體能量代謝的重要組成部分，一直以來都是研究熱點。此外，也有研究表明，咪唑類的離子液體會損害模式生物的肝臟[10]，誘導(dǎo)HepG2凋亡[17]。而肝臟作為代謝的中心，離子液體是否會對其糖代謝造成影響，這是我們想要探究的問題。

選用在工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的咪唑類離子液體中鏈長較短、毒性相對較小的1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)[8,18]，以人體肝癌細胞HepG2為實驗?zāi)Ｐ瓦M行體外實驗，旨在探究離子液體對糖代謝的影響及其機制，進一步明確咪唑類離子液體存在環(huán)境毒性，為水生生態(tài)環(huán)境污染物標準的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)藥品和試劑

離子液體[Bmim]Cl購自上海成捷化工有限公司(中國上海)，純度99%，實驗前稱取所需劑量的離子液體加入培養(yǎng)基配制成母液，根據(jù)實驗需要將母液逐級稀釋成所需濃度進行暴露實驗。實驗中所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所(中國南京)。SYBR綠色熒光染料購自Bio-Rad公司，總RNA提取Trizol試劑和cDNA第一鏈式合成試劑盒均購于Beyotime Biotechnology公司，細胞培養(yǎng)中所用的高糖DMEM培養(yǎng)基購于Thermofisher Scientific公司，胎牛血清(FBS)購于杭州天杭生物科技有限公司(中國杭州)，其他化學(xué)品和試劑均購于國藥化學(xué)試劑有限公司(中國北京)或北京索萊寶科技有限公司(中國北京)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人體肝癌細胞由江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院環(huán)境生態(tài)研究所提供，細胞加入配制好的培養(yǎng)基后放置于37 ℃、含有5% CO2的潮濕環(huán)境中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基配比為10%的FBS、1%的鏈霉素和青霉素以及88%的DMEM高糖培養(yǎng)基。實驗培養(yǎng)時為了排除FBS對實驗的影響，用0.2%的牛血清白蛋白(BSA)將其替換。

1.3 實驗設(shè)計

本次實驗分為2個部分：預(yù)實驗探索合適的暴露濃度，正式實驗探索合適濃度下[Bmim]Cl對細胞糖代謝的影響。預(yù)實驗設(shè)置1個空白組、1個純培養(yǎng)基組(無細胞)和7個[Bmim]Cl處理組，其暴露濃度分別為1、2、4、8、16和32 mmol·L-1。將處于對數(shù)增長期的細胞鋪入96孔培養(yǎng)板(每孔細胞量1×104個)中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長，將原培養(yǎng)基吸出，用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗3遍。加入含BSA和不同濃度[Bmim]Cl的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后測定培養(yǎng)基中消耗的葡萄糖和細胞活性，通過比較選定合適的暴露濃度。后續(xù)實驗選定濃度為1、2、4和8 mmol·L-1，在保持細胞密度不變的情況下擴大樣本數(shù)量放入6孔板中(每孔細胞量3×105個)進行暴露實驗，具體操作與預(yù)實驗保持一致，暴露結(jié)束后對各項指標進行測定。

1.4 細胞存活率測定

使用MTT法測定暴露后的細胞存活率，具體操作如下：在暴露24 h后吸出原培養(yǎng)基(用于測定葡萄糖)，用PBS溶液清洗3遍，加入配好的培養(yǎng)基100 μL和10 μL 5%的MTT溶液，在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄上清，加入DMSO溶液150 μL溶解甲瓚，用酶標儀測定其在570 nm波長下的吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率%=(暴露孔OD/對照孔OD)×100。

1.5 培養(yǎng)基內(nèi)消耗葡萄糖含量測定

培養(yǎng)基內(nèi)消耗葡萄糖含量測定參照Yan等[19]的方法對培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖消耗量進行測定，從側(cè)面反映實驗過程中細胞吸收葡萄糖的量。培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖含量通過商業(yè)化的葡萄糖測定試劑盒采用葡萄糖氧化酶法測得。消耗的葡萄糖含量(mmol·L-1)=純培養(yǎng)基組葡萄糖含量(mmol·L-1)-實驗組培養(yǎng)基葡萄糖含量(mmol·L-1)。

1.6 細胞內(nèi)糖原含量測定

細胞內(nèi)糖原含量使用商業(yè)化的糖原測定試劑盒(蒽酮比色法)和總蛋白測定試劑盒(BCA法)測得。具體操作如下：用胰蛋白酶消解暴露后的細胞，加入培養(yǎng)基后1 000 r·s-1離心3 min后得到細胞沉淀，加入0.5 mL PBS緩沖液，用超聲細胞破碎儀冰水浴破碎。取破碎后的溶液測定糖原含量，并測定其蛋白濃度。將糖原含量進行蛋白水平標準化。

1.7 RT-qPCR

用Trizol方法提取經(jīng)[Bmim]Cl暴露24 h的HepG2細胞RNA進行相關(guān)基因的表達分析。提取后的RNA用瓊脂糖電泳和超微量紫外分光光度計確定其未被DNA和蛋白污染，并使用cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Beyotime)進行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄完成后，將SYBR Green I(BIO-RAD)用作DNA結(jié)合染料，并將β-肌動蛋白(β-actin)用作內(nèi)部參考基因。使用primer5設(shè)計引物，引物設(shè)計完成后對其擴增效率進行驗證以確保實驗的可靠性。擴增程序設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，在52～57 ℃退火10 s，40個循環(huán)，最后繪制熔解曲線以測試是否存在非特異性產(chǎn)物。

1.8 統(tǒng)計分析

通過單向方差分析評估對照組和[Bmim]Cl暴露組之間的差異，并使用IBM SPSS Statistic 19(IBM Corp.，美國)對數(shù)據(jù)進行多次比較測試。所有分析均在P<0.05水平下確定統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細胞存活率及葡萄糖消耗量

如圖1所示，在不同濃度的[Bmim]Cl作用24 h后，隨著[Bmim]Cl濃度的升高，其細胞存活率呈下降趨勢。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，[Bmim]Cl濃度為16 mmol·L-1和32 mmol·L-1的處理組與空白對照組之間的細胞存活率存在顯著差異。

圖1 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細胞的存活率注：暴露時間為24 h；所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(SD)值表示，n=6； 與對照組相比，有顯著性差異，*P<0.05、**P<0.01；下同。Fig. 1 Survival rate of HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]ClNote: The exposure time was 24 h; all data are expressed by average± standard deviation (SD) value, n=6; compared with the control group, there was significant difference, *P<0.05, **P<0.01; the same below.

為探究非致死濃度下[Bmim]Cl對細胞糖代謝的影響，選取1、2、4和8 mmol·L-1作為處理組的濃度。以暴露后細胞消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖作為指標，分析HepG2細胞糖代謝的變化，結(jié)果如圖2所示。與空白對照組相比，[Bmim]Cl暴露后消耗葡萄糖的量發(fā)生了不同程度的變化，在暴露濃度為2 mmol·L-1的情況下培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗最少，由此可知該組細胞的糖代謝可能受到了較為嚴重的影響。結(jié)合圖1分析，在[Bmim]Cl暴露濃度為1、2、4和8 mmol·L-1時，細胞活性并未受到特別明顯的抑制，但是其消耗葡萄糖的量卻發(fā)生了明顯的改變。

圖2 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細胞 培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量Fig. 2 Consumption of glucose in HepG2 cell culture medium after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

2.2 細胞內(nèi)糖原含量

為探究不同濃度的[Bmim]Cl對HepG2細胞糖代謝的影響，測定了糖代謝中重要的生化指標糖原含量。如圖3所示，暴露于不同濃度的[Bmim]Cl中24 h后，其糖原的含量相較于空白對照組均有顯著降低。

圖3 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細胞內(nèi)糖原含量Fig. 3 Glycogen content in HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

2.3 對細胞糖代謝相關(guān)基因的影響

為研究[Bmim]Cl對HepG2細胞糖代謝影響的機制，考察了糖代謝中重要步驟的相關(guān)限速酶的基因表達情況。測定的基因及其作用如表1所示。

表1 糖代謝相關(guān)基因的名稱及作用Table 1 Names and roles of genes related to glucose metabolism

結(jié)果表明，細胞的GLUT1在暴露后表達有顯著下調(diào)，這與葡萄糖消耗量的變化對應(yīng)。糖酵解作為糖代謝的重要階段，其關(guān)鍵的限速酶PKM和PFKL的表達有相同趨勢的變化，基因的表達隨暴露濃度的增加而上升，與糖酵解相對應(yīng)的糖異生途徑的相關(guān)基因G6PC的表達出現(xiàn)了下調(diào)。糖酵解之后的另一重要階段檸檬酸循環(huán)階段的限速酶IDH2也出現(xiàn)了明顯的變化，該基因在暴露濃度為8 mmol·L-1時出現(xiàn)了特別顯著的上調(diào)。此外還檢測了與糖原合成與分解相關(guān)的基因PYGL、GYS2的表達情況，PYGL的表達出現(xiàn)劑量依賴式上升，而GYS2基因在中、低劑量暴露時其表達出現(xiàn)下調(diào)(圖4)。

圖4 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2中細胞中 糖代謝相關(guān)基因的表達情況Fig. 4 Expression of glucose metabolism-related genes in HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

3 討論(Discussion)

咪唑類離子液體作為被廣泛使用的有機溶劑，研究者選取了不同的實驗?zāi)Ｐ桶唏R魚、小鼠、小麥和人體肝癌細胞HepG2等，研究了咪唑類離子液體引起的致死效應(yīng)、氧化應(yīng)激以及遺傳毒性[20-22]，而其在低劑量非致死濃度下對細胞代謝的影響卻并未見報道。本實驗結(jié)果表明，[Bmim]Cl顯著減少培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖的消耗量，[Bmim]Cl暴露后細胞糖原含量顯著下降。肝細胞通過糖原分解、糖原合成和糖異生等作用消耗或產(chǎn)生葡萄糖，使體內(nèi)的葡萄糖達到穩(wěn)定狀態(tài)[17]。HepG2細胞中糖原分解生成的葡萄糖增加而從胞外吸收的葡萄糖減少。經(jīng)[Bmim]Cl暴露后測定了HepG2糖代謝中關(guān)鍵基因的表達情況。在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族中，GLUT1蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，是一種腫瘤標志物，其在腫瘤細胞的表達遠高于在普通細胞中的表達[23]。故其在HepG2細胞中表達情況在很大程度上能表征細胞對胞外葡萄糖的吸收情況，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)[Bmim]Cl暴露后GLUT1的表達出現(xiàn)明顯的下調(diào)，其結(jié)果與胞外葡萄糖消耗的結(jié)果相對應(yīng)。RT-qPCR和葡萄糖消耗的實驗結(jié)果存在一致性，兩者都表明[Bmim]Cl確實會影響HepG2細胞對葡萄糖的吸收，進而影響細胞的糖代謝。

糖原是葡萄糖在動物體內(nèi)的儲存形式，糖原的合成和分解代謝是生物體調(diào)節(jié)自身血糖和糖代謝的重要途徑[24-25]。本實驗測定了糖原分解代謝的關(guān)鍵基因PYGL和合成代謝的關(guān)鍵基因GYS2，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，暴露濃度為1、2和4 mmol·L-1的處理組，PYGL的表達上升而GYS2的表達下降，即基因的表達促進糖原分解酶的生成而抑制了糖原合成酶的生成，這導(dǎo)致了糖原分解加快而糖原生成減弱。結(jié)合葡萄糖消耗的研究，推斷這是由于細胞從胞外吸收的葡萄糖量減少，開始分解自身的糖原以此來維持機體的穩(wěn)定。而8 mmol·L-1的暴露組由于濃度過高已經(jīng)出現(xiàn)了代謝紊亂的現(xiàn)象，故其糖原的吸收和分解無規(guī)律。GSK3β是另一種參與糖原合成的關(guān)鍵基因，它編碼的酶通過磷酸化糖原合成酶(GS)來降低糖原的合成，該基因表達的上升也從另一個方面解釋了胞內(nèi)糖原減少的情況[26-27]。

糖酵解作為生物細胞共同的葡萄糖分解代謝途徑，是糖原分解形成的葡萄糖和胞外吸收葡萄糖分解代謝的必經(jīng)階段，而糖異生途徑恰好與之相反，是機體生成葡萄糖的重要途徑[25]。本實驗測定了糖酵解途徑的關(guān)鍵酶PFKL的表達情況，該酶催化果糖-6-磷酸向果糖-2,6-二磷酸轉(zhuǎn)化，有研究表明，PFKL的增加會促進糖酵解，同時抑制糖異生[28]，而本實驗還發(fā)現(xiàn)糖異生途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖6磷酸酶(G6PC)隨著濃度增加表達下降。由此可知，[Bmim]Cl暴露會在一定程度上促進HepG2細胞的糖酵解抑制糖異生，而且這種影響會隨濃度的升高而增加。

檸檬酸循環(huán)又稱為三羧酸循環(huán)，是糖類、脂質(zhì)和氨基酸的最終代謝通路。葡萄糖經(jīng)過糖酵解后生成丙酮酸，丙酮酸在有氧的情況下經(jīng)PDK1的催化后生成乙酰CoA然后進入檸檬酸循環(huán)[25]。探究了PDK1基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達隨暴露濃度的升高逐步上升。該反應(yīng)作為有氧糖酵解的下游反應(yīng)，出現(xiàn)這種變化恰好與前文PFK2的表達增加相呼應(yīng)。而TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶IDH2的表達并沒有出現(xiàn)相同趨勢的增長，這可能與TCA循環(huán)受多個代謝反應(yīng)影響有關(guān)，但可以肯定的是在最高濃度的[Bmim]Cl暴露下TCA循環(huán)受到了更加明顯的影響。

綜上所述，[Bmim]Cl暴露會影響HepG2細胞的糖代謝，具體表現(xiàn)為減少細胞對胞外葡萄糖的吸收，影響細胞內(nèi)糖酵解、糖原合成與分解、糖異生等相關(guān)代謝途徑，高濃度時甚至?xí)鸢麅?nèi)的糖代謝紊亂。