模式生物大型溞在水生生態毒理實驗教學中的應用

鞏寧，孟紫強，邵魁雙，孫野青

1. 大連海事大學環境科學與工程學院，環境系統生物學研究所，大連 116026 2. 山西大學環境科學研究所，山西大學環境醫學與毒理學研究所，太原 030006 3. 國家海洋環境監測中心，大連 116023

水生毒理學是生態毒理學的重要分支。而無脊椎動物是水生生態系統中關鍵的生物類群，基于無脊椎動物的毒理學測試方法及研究策略也成為水生生態毒理學教學和科研中必不可少的組成部分。

大型溞(Daphniamagna)是節肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、枝角目(Cladocera)和溞科(Daphnidae)中個體最大的一種浮游動物。生長于水草繁茂、營養豐富的淡水水體中，在世界范圍內廣泛分布。作為初級消費者，大型溞是初級生產者和高級消費者之間的紐帶，在水生生態系統中具有重要地位。由于易培養、繁殖快、對污染物敏感等特點，大型溞已經作為水生毒理學測試和評估的模式物種，被廣泛用于各類化學品(如重金屬納米粒子、有機磷殺蟲劑和藥物等新型污染物)的水生生物毒性測試和評估中[1-3]，成為水生毒理學測試的重要組成部分。近年來，隨著溞類生態學、毒理學和生理學研究的發展，針對溞類的完整水生毒理學研究平臺逐漸發展起來[4-6]，溞類水生毒理學在生態毒理學教學中的作用也愈顯突出。在孟紫強教授主編的新版《生態毒理學》(中國環境出版集團，2019)一書中，增加了“無脊椎動物毒性測試”(第九章，第四節)的內容，介紹了以大型溞或蚤狀溞(D.pulex)為受試生物進行的急慢性毒性試驗[7]。系統掌握溞類毒理學研究方法，已經成為生態毒理學及相關學科實驗教學中不可或缺的一部分。

本文基于已廣泛應用于環境監測和毒理學科研領域的大型溞毒性測試方法和研究策略，試圖構建可應用于本科生及研究生教學的水生生態毒理學實驗內容，為生態毒理學的教學和人才培養提供參考和借鑒。

1 大型溞的生物學特性與培養方法(The biological characteristics and culture methods of D. magna)

1.1 大型溞的生物學特性

大型溞成體體長2～6 mm，溞體呈寬卵形，左右側扁，無頸溝。身體被兩瓣透明介殼包裹，殼面上具網紋，頭部有黑色復眼一個(圖1)。第一觸角小，第二觸角發達，是主要的游泳器官。大型溞雌雄異體，在不良條件下行兩性生殖，在適宜條件下可長期孤雌生殖。兩性生殖中，雌體所產的卵需受精，稱為冬卵。冬卵脫離母體后需經過一定休眠時期才能發育成幼溞。孤雌生殖所產的卵為夏卵，不需受精即可發育成幼溞，且數量較多。在實驗室培養條件下，多以孤雌生殖為主[8-9]。

圖1 大型溞外部形態Fig. 1 The morphological features of D. magna

1.2 大型溞的實驗室培養

目前，針對大型溞的實驗室培養已有多種標準方法，如中國的國家標準GB/T 16125—2012[10]、美國材料與試驗協會(American Society for Testing and Materials, ASTM)的ASTM 1989[11]、國際標準化組織(International Organization for Standardization, ISO)的ISO 6341[12]以及經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)的OECD 202[5]等。參照這些標準方法，各實驗室可依據實際條件進行培養方案的設定。如可設定培養溫度為18～22 ℃、光暗周期比為16 h∶8 h。培養用水為能夠保證溞類存活的天然水、人工或半人工培養基等。培養用水pH為6～9，硬度(以CaCO3計)為140～250 mg·L-1，在使用前應充分曝氣使溶氧濃度達到飽和。每48 h或72 h半量或全量更換一次培養液。

大型溞可以攝食粒徑范圍在0.7～70 μm的藻類[13]。在實驗室培養中，常以近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)和斜生柵藻(Scendesmusobliquus)等為餌料。投喂量為每只動物0.1～0.2 mg C·d-1。藻類可按照OECD推薦的標準方法OECD 201[14]培養，培養條件為22 ℃±2 ℃、光照4 000～8 000 lx、光暗周期比16 h∶8 h。

2 大型溞在實驗教學中的應用(Application of D. magna in experimental teaching)

實驗教學是培養學生發現、研究和解決問題的有效教學手段，可分為基礎性實驗、綜合性實驗及實踐性實驗。受學時所限，基礎性實驗大多為驗證性項目。一般由教師事先準備好所需實驗器材，學生按照步驟操作即可。而綜合性和實踐性實驗教學學時較長(如連續進行1～2周)，可安排學生進行創新性設計和自主性探索，并對實驗結果進行綜合分析、查找出現錯誤或失敗的原因，更有利于學生創新能力的培養。由于篇幅所限，下文的實驗方案僅給出簡要描述及適用范圍，詳情可參考相關標準方法。

2.1 大型溞的外部形態觀察、體長測定與生物繪圖(2～4學時)

本實驗為基礎性實驗，為后續的溞類毒理學教學提供基本形態學認知。為此，教師在講授過程中可向學生展示大型溞的圖片或視頻，以豐富學生的感性認識，并說明生物繪圖的基本要點。即強調顯微鏡觀察和繪制同時進行，避免學生參照圖片“照貓畫虎”、草草了事。本實驗適用于水生生物學、浮游動物學等本科實驗教學，也可用于水生毒理學實驗的前期認知觀察。

實驗目的：以大型溞為例(如條件允許，也可選擇多種枝角類浮游動物進行觀察和比較)，了解枝角類浮游動物的外部形態特征(圖2)；學習使用體式顯微鏡進行生物材料的觀測；掌握生物繪圖的基本技能。

圖2 枝角類雌體模式圖[15]注：1.頸溝；2.吻；3.頭盔；4.殼??；5.腹突；6.尾剛毛；7.后腹部；8.尾爪； 9.肛刺；10.殼刺；11.夏卵；12.第一觸角；13.第二觸角；14.大顎；15.上唇； 16.胸肢；17.腦；18.視神經節；19.復眼；20.動眼肌；21.單眼；22.食道； 23.中腸；24.直腸；25.盲囊；26.心臟；27.顎腺；28.卵巢；29.生殖孔。Fig. 2 The pattern diagram of female Cladocera[15]Note: 1. cervical notch; 2. mouth; 3. helmet; 4. lateral head ridges; 5. abdominal processes; 6. postabdominal setae; 7. posterior abdomen; 8. postabdominal claw; 9. anal spines; 10. shell spines; 11. embryo; 12. first antennae; 13. second antennae; 14. mandible; 15. labrum; 16. thoracic appendage; 17. brain; 18. optic ganglia; 19. compound eyes; 20. oculomotor muscle; 21. ocellus; 22. prosogaster; 23. midgut; 24. rectum; 25. caecus; 26. heart; 27. shell gland; 28. ovary; 29. genital pore.

實驗方法簡介：準備大型溞活體，置于60 mL小燒杯中，每組5～10只，肉眼(或用放大鏡)觀察大型溞在水中的運動情況。用塑料吸管吸取1只活動正常的健康大型溞，置于載玻片中央，加少許培養液避免完全干燥。將載玻片放置在體式顯微鏡的載物臺上，按照操作規程觀察，并繪制大型溞外部形態圖。

2.2 理化因素對大型溞心率的影響(2～4學時)

大型溞身體透明，便于觀察及測定心率。研究表明，溞類有類似于哺乳動物的肌原性心臟組織，對能影響人類心率變化的一系列受體激動劑和拮抗劑，表現出相似的反應特征[16]。多種環境污染物，如鎘離子、全氟辛烷磺酸和四氫嘧啶等，均可導致大型溞心率的紊亂[17-19]。因此，心率觀察可作為大型溞的一個易于觀測的生理學指標，用于反映各種脅迫條件對水生動物的影響，并可作為反映水質污染程度的生物學指標。在學生實驗中，考慮到安全性因素，可選擇1%～20%的乙醇溶液作為實驗毒物。除此之外，重金屬離子、pH(4～11)和鹽度(1～8)的變化等也可作為脅迫因素[17]。

實驗目的：探究水體中的化學因素(如乙醇)對大型溞的生理影響；通過劑量-效應曲線的繪制及半數效應濃度(effect concentration 50%, EC50)的計算，理解毒理學中的劑量-效應關系。

實驗方法簡介：選擇產自同一母體、生長狀態良好、活動正常的大型溞幼溞(<24 h)用于實驗。乙醇測試液的濃度分別為1%、5%、10%、15%和20%，并設置空白對照組(清水)。實驗時，取1滴清水放在載玻片中央，用吸管吸取1只大型溞放在清水里，放置在體式顯微鏡下，緩慢蓋上蓋玻片，用秒表和計數器記錄大型溞的心率(可僅記錄10 s)；用吸水紙將水吸干，滴加2～3滴1%的乙醇溶液，從蓋玻片另一側用吸水紙吸取乙醇溶液，使大型溞處于乙醇溶液中，5～10 s后，記錄大型溞的心率；重復上述步驟，分別記錄其他濃度乙醇溶液中大型溞的心率。每個濃度測量3～5只大型溞，并取平均值作為該濃度下的大型溞心率。如大型溞心率過快難以計數，可通過CCD顯微攝像等設備輔助記錄。

2.3 理化因素對大型溞攝食能力的影響(2～4學時)

水中污染物不僅會影響大型溞的心率，還可能對其攝食能力產生影響，進而對動物的個體生長、繁殖造成干擾，甚至影響到種群的數量。通過對大型溞攝食率和濾水率的測定，可很好地反映其攝食能力的變化[15-16]。本實驗可與2.2中的實驗內容相結合，設置綜合性實驗。

實驗目的：探究水中污染物對大型溞攝食能力的影響；掌握大型溞攝食行為的測定方法。

實驗方法簡介：實驗用動物與2.2相同。脅迫因素可選擇重金屬離子、有機污染物和微納米顆粒等進行暴露處理，本文以鎘離子為例進行介紹。在實驗前48 h，教師應配制質量濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.08和0.1 mg·L-1的CdCl2(CdCl2·5H2O，分析純)溶液，再將實驗用幼溞(<24 h)隨機置于測試液中，每組加入10只幼溞。向各組中加入初始密度為5×105個·mL-1的普通小球藻(也可用近頭狀偽蹄形藻、斜生柵藻等代替)，并設置一個空白對照組(僅有數量相同的藻類但無大型溞)。實驗開始時，指導學生從各組中移取一定數量大型溞培養液，根據實驗條件，選用血球計數板計數法或光密度法測定小球藻的密度。并參考如下公式計算大型溞的濾水率(F)和攝食率(G)：

F=V/N(lnCt-lnCtf)/t

(1)

G=V/N(lnCt-lnCtf)/t·(Ctf-C0)/(lnCtf-lnC0)

(2)

式中：F為濾水率(mL·只-1·h-1)，即單個大型溞單位時間過濾的食物溶液體積；G為攝食率(個·只-1·h-1)，即單個大型溞單位時間攝入的藻細胞數量；V為食物溶液體積(mL)；N為大型溞的數量(只)；C0為起始小球藻濃度(個·mL-1)；Ct為對照組中最終小球藻濃度(個·mL-1)；Ctf為試驗組中剩余小球藻濃度(個·mL-1)；t為攝食時間(h)。

指導學生對獲得的數據進行統計分析，利用統計軟件獲得鎘離子對大型溞濾水率和攝食率的EC50。

2.4 大型溞活動抑制實驗(48 h急性毒性實驗)

本實驗適用于檢測水中化合物的急性毒性。毒理學終點為大型溞的活動抑制(包括死亡)。該實驗耗時較長，適用于本科生的綜合性和實踐性教學。

實驗目的：以年齡<24 h的幼溞為實驗動物，通過48 h的急性暴露，得到相應時間點的半數致死濃度(lethal concentration 50%, LC50)；掌握大型溞活動抑制的實驗方法。

實驗方法簡介：實驗方案可參考標準測試方法[5,10-12]。仍以鎘離子為受試化合物進行介紹。在實驗開始前，授課教師需進行預實驗或查閱相關文獻，確定正式試驗的濃度范圍。為了得到相對完整的劑量-效應曲線，正式實驗時可按等比間距設置5個以上鎘離子濃度。暴露實驗可用小燒杯或六孔板為實驗容器。每個濃度設置3個平行，每個平行5只大型溞，暴露溶液至少20 mL，實驗期間不喂食。在暴露實驗中，每天定時檢查大型溞的狀況，記錄出現的異常情況。在暴露終點(24 h或48 h)，計數活動能力受到抑制(包括死亡)的大型溞數量，計算24 h或48 h的EC50。判斷大型溞活動抑制(immobilization)的方法為：輕輕搖動實驗容器，如果15 s之內大型溞不能游動，認為其運動能力受到抑制。進一步可通過觀察活動抑制個體的心跳，判斷大型溞是否死亡。指導學生依據實驗結果撰寫實驗報告。

2.5 大型溞繁殖抑制實驗(21 d慢性毒性實驗)

在溞類毒理學測試中，如果急性毒性測試確定某測試物具有顯著性抑制作用，將進行繁殖抑制實驗以確定該測試物的慢性毒性。該實驗重點關注以大型溞的繁殖能力為指標的亞致死效應，同樣可參照標準測試方法進行實驗[6,20]。在這些標準方法中，以21 d為一個周期的慢性毒性測試最為常用。如前所述，枝角類的生活史由交替進行的孤雌生殖世代和兩性生殖世代組成，在正常的生活環境下以孤雌生殖為主。只有當環境惡化，如溫度變化、食物匱乏或密度過大時，大型溞才會形成冬卵以度過不良環境[9]。本實驗室前期研究也表明(未發表數據)，健康幼溞(< 24 h)經過21 d培養，可產生10～30只后代(3～7 d繁殖一次)。因此，在進行本實驗前，教師應檢查實驗用大型溞的培養條件(可參見前文)，保證有足夠健康幼溞用于測試。

實驗目的：以年齡<24 h的幼溞為實驗動物，通過21 d的慢性暴露，得到引起大型溞繁殖抑制的EC50；掌握大型溞繁殖抑制的實驗方法。

實驗方法簡介：所用測試物的濃度將依據已得到的急性測試的半數效應濃度來設置，一般在EC50值以下，按照等比間距設置5個以上濃度。實驗用溞仍為來自于同一親體，溞齡<24 h的幼溞(親溞)。隨機選擇健康幼溞，暴露于一定濃度范圍的測試溶液中，每只一個容器，實驗周期為21 d，暴露期間投喂適量的食物以保證大型溞的生存和繁殖?？瞻讓φ战M和各濃度測試組均設置10個平行，每個平行1只親溞，置于玻璃燒杯或六孔板中。每日檢查每個容器中的親溞存活狀態及是否有幼溞產生，將幼溞挑出并計數，清理容器中的殘餌和蛻皮。試驗結束時(21 d)，對每只存活親溞繁殖的存活幼溞的總數量進行統計(不包括試驗期間死亡的幼溞)。還可對其他終點指標進行統計以表示親溞的繁殖量，如每只親溞的繁殖次數、親溞的頭胎產溞時間和實驗終點親溞的體長等。最后，通過對暴露于受試物中的親溞繁殖量與對照組的比較，確定EC50值或最低可觀察效應濃度(lowest observed effect concentration, LOEC)和無可觀察效應濃度(no observed effect concentration, NOEC)，并指導學生撰寫實驗報告。

該實驗周期長，統計指標多。適合有研究生參與(助課)下的本科生實踐教學。通過該實驗，可對學生進行完整實驗周期的訓練，如文獻查閱、實驗設計、測試液的配制、暴露實驗的開展、實驗數據的記錄、整理和統計等。還可結合2.4中的大型溞活動抑制實驗結果，訓練學生在實驗報告的基礎上進行學術論文的撰寫。通過訓練，不僅可鞏固學生對所學的實驗技術、方法及原理的掌握，還可以培養學生的創造性思維及獨立進行科學研究的能力。

3 展望(Perspective)

本文僅從形態學、生理學和毒性測試角度對以大型溞為實驗動物的教學方案進行了設置。但近年來，隨著水蚤分子毒理學的建立和發展，大型溞的分子毒理學及組學研究也取得了長足的進步。人們可以利用大型溞的基因組、轉錄組等信息，對污染物的毒性作用靶點和關鍵信號通路進行分析，以揭示污染物的損傷作用及毒性機理[21-22]。此外，還可利用表觀遺傳組學技術，對污染物的代際傳遞效應進行探討，進而從種群水平對污染物的生態風險進行評估[23]。上述研究成果均可豐富到實驗教學體系中來。例如，可根據研究目的，選擇不同的目標分子設計實驗，在轉錄水平、蛋白表達水平或酶的活性水平上進行測試(如膽堿酯酶活性可作為神經毒性測試的分子標志物)，訓練學生將分子指標的改變與毒理學、生理學測試結果相結合，進行測試物生物毒性的綜合評價。這些綜合性的創新實驗將有利于培養高級應用型人才，推動生態毒理學教學的發展。

總之，大型溞作為水生無脊椎動物中的模式物種，可為毒理學測試提供準確有效的毒性數據，成為水生毒理學研究中不可缺少的環節。實驗教學是培養學生動手能力、創新意識和創造性思維的重要平臺，在生物學、環境學和生態學等相關專業的學生實驗教學環節中，引入和建立以大型溞為實驗材料的實驗教學體系，是可行并且必要的。在實驗教學內容的編排上，可本著由易而難的原則，兼顧基礎和前沿，根據課時要求對上述實驗內容酌情增減，以滿足不同程度學生的教學需求。