48個苜蓿品種對3種病害抗性的初步評價

李彥忠，喻軍強，李明

（蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學甘肅省西部草業技術創新中心，蘭州大學草業科學國家級實驗教學示范中心，蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅蘭州730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa，簡稱為苜蓿）是全世界重要的豆科類牧草，在農牧業生產中發揮著極其重要的作用［1］。據統計，苜蓿在全世界的種植面積約3220萬hm2，和小麥（Triticum aestivum）在美國并列成為第三大重要作物；我國紫花苜蓿種植面積約377萬hm2，居各類栽培牧草之首，主要分布于西北、華北和東北地區［2－5］。因其蛋白質含量高、氨基酸含量豐富、產量高、適口性好，故有“牧草之王”的美譽［6］。苜蓿栽培草地的種植規模和生產水平是衡量一個國家畜牧業現代化程度的重要標志［7］。但是目前我國苜蓿產業發展存在諸多問題，最主要的問題是產不足需、質量水平不高［8－9］。隨著我國畜牧業的快速發展，其對苜蓿的需求量越來越多，而現階段無論在數量上還是在質量上，我國生產的苜蓿均無法滿足畜牧業生產的需要［10－11］。2016年我國進口苜蓿近150萬t，進口量約為2008年的80倍。據估計近年我國苜蓿約50%的需求總量仍需依賴進口［11］。

苜蓿病害會降低草產品的質量和生產性能，并且會危害家畜健康，我國在紫花苜蓿上已發現36種真菌病害［12］。苜蓿褐斑病（Pseudopeziza medicaginis）是一種常見的苜蓿病害，隨著病害程度的加深，病葉與健葉相比，光合速率和粗蛋白含量均顯著下降，葉片中總酚、單寧、鈣、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分均顯著增加［13－14］。由夏季霜霉菌（Peronospora aestivalis）引致的苜蓿霜霉病是一種世界性病害，嚴重影響世界各國的苜蓿產業發展［15］。在我國，已知該病分布于14個省，不同海拔地區均有分布，均可造成危害［15］。其可使苜蓿的草產量、品質、種子產量和根瘤大幅度下降［16］；能明顯影響苜蓿的生理和生物學性狀，感染植株與健康植株相比，株高、分枝數、花序數、水分含量和葉綠素含量均出現不同程度的下降［17］；能使苜蓿葉片光合作用降低，有機物貯量和根系養分積累減少，植株越冬不良，草地提早衰敗退化，已成為我國苜蓿生產的主要限制性病害之一［18］。據統計，全世界每年由根腐病造成的苜蓿產量損失在20%左右，嚴重時高達40%［19－20］。苜蓿根腐病普遍發生在我國西北（甘肅、新疆、青海等）、華北（河北和內蒙古等）和東北地區（黑龍江和吉林等）等苜蓿主要種植區，其能降低植株根系吸收水分的能力，影響幼苗的正常生長，從而導致植株生物量下降，甚至使植株死亡［21－23］。

防治苜蓿病害的措施有很多，抗病品種的利用是防治苜蓿及其他牧草病害的最有效和最主要的措施之一［15，24－27］。因此，本研究于2015年對在蘭州大學榆中校區試驗地種植的48個苜蓿品種進行了田間病害調查，調查發現試驗地內的主要病害是褐斑病、霜霉病和根腐病。安歡樂［28］經分離培養、形態學鑒定、分子鑒定、致病性測定和再分離，最終確定根腐病的主要病原為銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）。并對48個品種進行了綜合評價，以期篩選出優良、優質和抗病性強的苜蓿品種，為選擇適合當地種植的苜蓿品種和抗病育種材料的選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于蘭州大學榆中校區，屬溫帶大陸性氣候，海拔1680 m（35.87° N，104.09° E），年均降水量為381.8 mm，蒸發量為1450 mm，無霜期120 d左右，相對濕度63%，全年日照時數2607.2 h，年平均氣溫為6.7℃，1月平均氣溫－8℃，7月平均氣溫19.0℃，試驗地平坦，在苜蓿生長期灌溉2～3次，采用大水漫灌。于2013年6月進行播種。

1.2 供試苜蓿品種

總計48個供試苜蓿品種（表1）。

表1 供試苜蓿品種及其來源Table 1 Alfalfa varieties and their resources in the experiment

1.3 田間試驗設計

采用隨機區組試驗設計，每個品種3個重復，小區面積5.0 m×2.4 m，小區間距0.6 m，穴播，每個小區共計24株苜蓿，株距和行距均為0.6 m，在苜蓿生長期灌水3次，未施肥。

1.4 病害調查與抗病性評價

1.4.1 病情分級標準 各地上病害的分級標準根據田間發病情況并參照北美苜蓿會議（North American Alfalfa Improvement Conference，NAAIC）的標準略有改動后制定分級標準［29］，共分為5個病級，其中0級，植株莖葉無病斑，葉片呈正常的綠色；1級，病斑占葉片面積的25%以下；2級，病斑占葉片面積的26%～50%，并且葉片開始褪綠；3級，病斑占葉片面積的51%～75%，病斑壞死且葉片發黃；4級，病斑占葉片面積的75%以上，葉片發黃并脫落。

1.4.2 病害調查 于2015年5－7月對病害進行了調查，用一般調查和重點調查相結合的方法。一般調查主要了解苜蓿病害的分布以及發病程度，進行分析歸類。一般調查后將發生嚴重的病害進行重點調查，深入了解其分布、發病率、發生規律等［30］。統計每小區內（全部植株）發病植株數和各病級植株數，計算發病率和病情指數。

1.4.3 抗病性評價標準 參照美國苜蓿和牧草聯盟（National Alfalfa & Forage Alliance，NAFA，2019）的標準，根據健康植株的百分比確定每個品種的抗病級別（表2）。

表2 抗病性評價標準Table 2 Evaluation criteria of resistance ratings

1.5 測定指標

統計每小區內所有植株的株高（地面至最高處垂直距離）和分枝數。

1.6 綜合評價

采用隸屬值函數標準差系數賦予權重法進行綜合評價，具體步驟如下［31］：采用公式（1）計算各個指標的隸屬函數值。

式中：μ（Xj）代表第j個指標的隸屬函數值；Xj表示第j個指標值；Xmin表示第j個指標的最小值；Xmax則表示第j個指標的最大值。如果指標與抗病性呈正相關時用公式（1）計算該指標的隸屬函數值，若指標與抗病性呈負相關時用公式（2）進行反隸屬函數進行轉換，計算該指標的隸屬函數值。

采用公式（3）計算標準差系數（Vj），歸一化后得到各個指標的權重系數（Wj），見公式（4）。

采用公式（5）計算各品種的綜合評價值。

式中：D為用若干指標綜合評價所得的綜合評價值。根據D值的大小對供試材料抗病性的強弱進行排序，D值越大抗病性越強，反之則越弱。

1.7 統計分析

采用Excel 2010、SPSS 25.0進行數據的處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 48個苜蓿品種累計死亡率比較

48個品種的累計死亡率介于0～93.07%，累計死亡率最高的是UC-1465，為93.07%；累計死亡率介于26%～74%的品種有8個，分別是Avrora、甘農5號、Hunter Field、Hunter River、Saranac AR、Siriver、Trifecta、UC-1887；累計死亡率介于1%～3%的品種有11個，分別是Derby、Vertus、甘農4號、寧苜1號、蔚縣、圖牧1號、圖牧2號、草原2號、Sanditi、中蘭1號、中苜1號；其余28個品種的死亡率均為0；品種間差異顯著（P＜0.05）（表3）。

表3 48個苜蓿品種的累計死亡率Table 3 Cumulative mortality rate of 48 alfalfa varieties

2.2 48個苜蓿品種株高和分枝數比較

不同品種間的同一指標各有差異。從株高來看，48份苜蓿材料的株高在0～67.50 cm（表4），株高最高的品種是中蘭1號；株高為0 cm的品種有15個，分別是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農1號、甘農3號、甘農6號、中牧1號；株高介于50～64 cm的品種有9個，分別是新牧1號、Vertus、隴東苜蓿、天水、新疆大葉、中苜1號、中苜3號、公農2號、蔚縣；株高介于1～16 cm的品種有3個，分別是Trifecta、Arc、Sanditi；其余20個品種的株高介于17～49 cm；品種間差異顯著（P＜0.05）。

表4 48個苜蓿品種株高和分枝數比較Table 4 Comparison of plant height and branch number of 48 alfalfa varieties

從分枝數來看，48份苜蓿材料的分枝數在0～56枝（表4），分枝數最多的品種是Vertus，為56枝；分枝數為0的 品 種 有15個，分 別 是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農1號、甘農3號、甘農6號、中牧1號；分枝數介于30～56枝的品種有11個，分別是Vertus、中苜1號、公農1號、公農2號、中蘭1號、蔚縣、中苜3號、新疆大葉、隴東苜蓿、天水和新牧1號；分枝數介于1～10枝的品種有7個，分別是Arc、Sanditi、Trifecta、Vernal、甘農4號、Jindera和甘農7號；其余15個品種的分枝數介于11～29枝；品種間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同苜蓿品種間抗褐斑病的比較

48個苜蓿品種褐斑病的發病率在33.33%～100.00%（表5），且不同品種褐斑病的發病率存在顯著差異（P＜0.05）。其中發病率最低的是UC-1465，發病率僅為33.33%；發病率達到100%的有20個品種，分別是Vertus、WL168HQ、WL354HQ、WL343HQ、公農2號、甘農1號、甘農3號、甘農5號、甘農6號、甘農7號、中蘭1號、寧苜1號、新疆大葉、Jindera、天水、蔚縣、中苜3號、無棣、隴中、圖牧1號；其余27個品種的發病率介于34%～99%。

48個苜蓿品種褐斑病的病情指數范圍為17.78～52.22（表5），其中UC-1887、Vernal的病情指數均最低，僅為17.78，并與甘農1號、新牧2號存在顯著差異（P＜0.05）；病情指數高于52的材料有2份，分別為甘農1號、新牧2號，其余44個品種的病情指數介于18～52。

參照NAFA標準，48個苜蓿品種對褐斑病的抗性是UC-1465為高抗（HR）品種，UC-1887為抗病（R）品種，Siriver和Trifecta為中抗（MR）品種，Avrora、Hunter River、Saranac AR為低抗（LR）品種，其余41個品種均為感病（S）品種（表5）。

表5 48個苜蓿品種的褐斑病發病情況及其抗病級別Table 5 Incidence of common leaf spot and resistance level of 48 alfalfa varieties

2.4 不同苜蓿品種間抗霜霉病的比較

48個苜蓿品種霜霉病的發病率在0～27.77%（表6），其中Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘農1號、甘農3號、甘農6號、中牧1號的發病率為0；新疆大葉和天水的發病率均最高，為27.77%；其余32個品種的發病率介于1.37%～25.63%。

48個苜蓿品種霜霉病的病情指數范圍為0～81.67（表6），其中Avrora、Hunter Field、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農1號、甘農3號、甘農5號、甘農6號、中牧1號的病情指數為0，并與品種蔚縣、中苜1號等存在顯著差異（P＜0.05）；病情指數高于78的材料有4份，分別為新疆大葉、蔚縣、中苜1號、新牧1號；其余27個品種的病情指數介于1～78。

參照NAFA標準，48個苜蓿品種均高抗苜蓿霜霉病（表6）。

表6 48個苜蓿品種的霜霉病發病情況及其抗性級別Table 6 Incidence of downy mildew and resistance level of 48 alfalfa varieties

續表Continued Table

2.5 不同苜蓿品種間抗銳頂鐮刀菌根腐病的比較

48個苜蓿品種銳頂鐮刀菌的發病率在0～33.33%（表7），其中發病率最低的是Saranac、Siriver、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘農3號、中蘭1號、Jindera、天水、中苜3號、無棣、隴中、甘農2號，發病率為0；發病率最高的是UC-1465，為33.33%；其余33個品種的發病率均介于1.40%～27.77%。

參照NAFA標準，48個苜蓿品種均高抗苜蓿銳頂鐮刀菌根腐病（表7）。

表7 48個苜蓿品種銳頂鐮刀菌根腐病發病情況及其抗性級別Table 7 The incidence and resistance level of F.acuminatum root rot in 48 alfalfa varieties

2.6 紫花苜蓿種質資源綜合評價

采用隸屬值函數結合各個指標的權重系數，對48個苜蓿品種進行綜合評價［31］。D值越大，表明該品種抗病性越強，反之越弱。根據D值的大小進行排序，排在前面3個的苜蓿品種為Vertus、中蘭1號和新牧1號；評分最低的3個品種為UC-1887、UC-1465和Saranac AR（表8）。

表8 48個苜蓿品種的綜合評價得分及其排序Table 8 Comprehensive evaluation scores and ranking of 48 alfalfa varieties

續表Continued Table

3 討論

研究表明，銳頂鐮刀菌可以侵染植物的根莖部和根部，同時也可作為初侵染和次侵染而引起植物根腐病的發生［32－34］。本研究發現在蘭州大學榆中校區品種比較試驗田中，苜蓿矮小、萎蔫、死亡植株較多，且在死亡苜蓿植株上分離到了銳頂鐮刀菌等病原真菌，安歡樂［28］經過致病性測定和再分離發現，銳頂鐮刀菌致病性最強，再分離率也較高，可導致植株根部和根莖部出現明顯的變色，這是本研究中死亡植株較多的主要原因。

李春杰等［15］、金娟等［35］、陳申寬等［36］、辛寶寶等［37］分別對苜蓿品種在不同地區主要病害進行抗性評價和鑒定，本試驗得到的結果與這些學者有所不同，可能是由于評價方法不同引起的，本試驗是以健康植株比例為主要指標進行評價的，而李春杰等［15］、陳申寬等［36］、辛寶寶等［37］是以發病率和病情指數為指標進行評價的，金娟等［35］是以相對抗性指數為指標進行評價的。因此應該建立統一的抗病評價體系和指標，這樣能夠更有效地篩選適合我國不同地區種植的苜蓿抗病品種，以便加速中國苜蓿產業的發展。

在進行不同苜蓿品種抗真菌病害的評價時，參考指標主要有發病率、病情指數、形態學指標和生理學指標等，所有的這些指標都從不同的層面反映出植物對于病害的響應，即使忽略各指標間的差異，僅采用單一指標進行評價，不能充分體現苜蓿材料的綜合表現［38］。因此需要構建綜合評價模型，將以上指標進行整合，通過科學的計算和分析，客觀地將所有品種按照抗病性進行分類，以便應用于生產實踐中［39］。目前，應用綜合評價模型對品種的綜合性能進行評價的研究較少，本試驗應用的隸屬函數分析法，克服了用單一指標來評價苜蓿抗病性存在片面性和不穩定性的弊端，評價結果更可靠。

4 結論

本研究在甘肅省榆中縣對48個苜蓿品種進行了抗褐斑病、霜霉病及銳頂鐮刀菌根腐病的評價，結果表明：供試的48個苜蓿品種均高抗霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病，對褐斑病的抗性品種為高抗品種1個（UC-1465），抗病品種1個（UC-1887），中抗品種2個，低抗品種3個，其余41個品種均為感病品種。

對48個苜蓿品種進行隸屬函數分析，結果表明：Vertus、中蘭1號和新牧1號對褐斑病、霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病均具有較強的抗病性，為高抗品種；UC-1887、UC-1465和Saranac AR對褐斑病、霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病的抗病性均較差，為感病品種。若以上3種病害在該地區造成重大損失時，應首選上述高抗品種在該地區進行栽培種植。