內生真菌對高寒草地紫花針茅凋落物分解的影響

宋梅玲，王玉琴，王宏生，鮑根生

（省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海大學畜牧獸醫科學院，青海省高寒草地適應性管理重點實驗室，青海西寧810016）

凋落物分解是陸地生態系統中碳素周轉和礦質養分循環的重要過程［1］，并且具有調節土壤有機物組成的作用［2］，是釋放礦質養分供植物生長的重要過程，并由此影響陸地生態系統凈生產力［3］。凋落物分解率可以被生物和非生物因素所影響，決定分解率的因素主要有3個，分別為氣候因素（如溫度和水分）、凋落物質量（如化學成分）以及分解生物的特性和數量（如細菌、真菌和土壤無脊椎動物）［4］。最初的凋落物質量（如：C/N、纖維素、木質素）可以影響參與凋落物分解的微生物的多度、組成和活性，而這些也反過來決定凋落物的分解速率和養分循環［5］。

近年來，各國學者對于內生真菌與其宿主植物（禾草）和食草動物之間的相互關系及其在不同生態環境中的多樣性已開展了大量的研究［6－9］。內生真菌與禾草在生態系統中維持著一種互利共生的關系，對于內生真菌來說，宿主禾草保證了其在植物體內生長所必需的營養物質和可靠有效的傳播，而對于禾草來說，內生真菌通過其自身產生的次生代謝物保護了植物，使其免受外界環境脅迫的危害［10－11］。這種共生關系已經被證明可以影響生態系統過程，如土壤呼吸、凋落物分解等［12－13］。內生真菌通過改變微生物量及微生物群落結構，或宿主植物凋落物的數量和質量［14－15］影響凋落物分解速率。

紫花針茅（Stipa purpurea）草原是青藏高原地區高寒草地中分布面積較廣、最具有代表性的草地類型。其建群種紫花針茅系寒旱生植物，粗蛋白含量高，粗纖維少，營養價值比較高［16］，且具有耐寒、耐旱、耐踐踏和抗風沙等特性［17－18］。主要分布在海拔1900～5150 m的高原地帶，是青藏高原、帕米爾高原和中亞高山地帶的特有植物［19］。紫花針茅內生真菌主要為無性繁殖的Epichlo?屬內生真菌，近年來，有關紫花針茅與內生真菌之間相互關系的研究較多，如紫花針茅內生真菌分離和鑒定，紫花針茅內生真菌共生體對根寄生危害的響應等［19－20］。然而，關于內生真菌對紫花針茅凋落物分解的影響及其機制的研究尚未見報道。

本研究通過對比帶內生真菌與不帶內生真菌紫花針茅之間的凋落物分解特征差異，明確內生真菌對宿主植物凋落物分解過程的影響（包括凋落物重量和質量等變化），以期揭示禾草內生真菌對草地生態系統元素循環中凋落物分解的作用，為禾草內生真菌共生體在高寒草地的利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 凋落物采集

2017年9月，于青海省海北州海晏縣（N 37°04′01″，E 100°52′48″）天然草場采集紫花針茅花序，每單株裝于一個信封袋。將采自野外的紫花針茅花序分別按照李春杰等［21－22］的方法進行內生真菌檢測，采集帶菌植株的種子并通過高溫高濕法進行去除內生真菌的處理，建立帶內生真菌（E+）與不帶內生真菌（E－）無性繁殖系種群。將處理好的E+、E－種子分別種植于花盆中，置于溫室，使其自然生長。待植株長到枯黃時，采集地上植株，自然風干，作為凋落物備用。

1.2 試驗設計

2018年12月，將E+、E－紫花針茅植株凋落物分別剪成5 cm的小段，稱取5.00 g裝入1 mm孔徑的尼龍網袋（大小為：10 cm×10 cm），共計36個網袋，放置到海北州海晏縣試驗點，每個網袋間距大于10 cm，放置前清除地上植物組織，確保網袋均勻平鋪在地表與土壤直接接觸，并用大頭針固定。在放置網袋后的第0、3、6、8、10、12個月隨機采集凋落物網袋，每次每個處理采集3個網袋，以備后續試驗用。

1.3 分析方法

網袋取出后，將凋落物全部取出，放置到實驗室自然風干，之后過0.25 mm篩后稱重。根據Olson［23］的指數分解模型公式，計算凋落物分解速率k值：

式中：X表示經過t年分解時間后凋落物的殘留量；X0為凋落物初始量（5 g）。根據此公式，可模擬出凋落物殘留率隨時間變化的指數回歸方程，進而推算出不同凋落物分解50%即半分解時間和分解95%所需的時間。

每次采集的網袋中的樣品都需要測定其全氮、木質素和纖維素含量。其方法為：全N含量運用全自動凱氏定氮儀（Kjeltec 2300 Auto SystemⅡ，Foss Tecator AB，瑞典）進行測定。木質素和纖維素的含量則依據酸性洗滌纖維法進行測定［24］。同時，計算每個分解階段的凋落物木質素/N以及N殘留率、木質素殘留率和纖維素殘留率等。

元素殘留率（R）：

式中：Ct為t時刻凋落物元素含量（mg·g－1）；Xt為t時刻凋落物干重（g）；C0為初始元素含量（mg·g－1）；X0為初始干重（g）。

1.4 數據分析

數據運用SPSS 17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL）軟件進行分析，E+與E－之間凋落物重量、全N、木質素和纖維素含量、木質素∶N、纖維素∶N以及全N、木質素和纖維素的殘留率等的差異顯著性采用獨立樣本T檢驗的方法進行檢驗，內生真菌對紫花針茅凋落物重量、全N、木質素和纖維素含量、木質素∶N、纖維素∶N以及全N、木質素和纖維素的殘留率等不同時間的影響采用重復度量方差分析方法進行檢驗，顯著性區間定義為95%水平。

2 結果與分析

隨著時間的延長，E+與E－紫花針茅凋落物重量都大幅度下降，其中0～8個月，凋落物重量下降速度較快，而8～12個月，下降速度趨于平緩（圖1）。相對而言，E+紫花針茅的凋落物重量下降速度比E－快，且自第6個月以后，E+植株的凋落物重量顯著低于E－（P＜0.05，圖1）。時間和內生真菌均對紫花針茅凋落物重量產生了顯著影響（P＜0.001），二者之間無顯著交互作用（P＞0.05，表1）。

圖1 E+和E-紫花針茅凋落物重量隨時間的變化Fig.1 The change of E+and E-S.purpurea litters weight over time

E+與E－紫花針茅凋落物分解系數分別為0.793和0.616（表2）。據此推算出，E+紫花針茅凋落物的半分解時間為0.84年，分解95%的時間為3.75年。而E－紫花針茅凋落物的半分解時間為1.14年，分解95%的時間為4.87年（表2）。因此，內生真菌縮短了紫花針茅植株凋落物的分解時間。

表2 E+和E-紫花針茅凋落物分解特征參數Table 2 Decomposition characteristics parameters of E+and E-S.purpurea litters

E+和E－紫花針茅凋落物中全氮含量隨時間的延長有增加的趨勢，其中，第6、10和12個月，E+紫花針茅凋落物中全氮含量均顯著高于E－（P＜0.05，圖2a），內生真菌和時間對凋落物全氮含量產生了顯著影響，且二者之間有顯著的交互作用（P＜0.05，表1）。另一方面，E+和E－紫花針茅凋落物中木質素含量均隨著時間的延長迅速降低（圖2b），至第8個月時，E+和E－凋落物中木質素含量均降至初始含量的1.5%以下，且隨著時間的延長，E+凋落物的木質素含量由初始的顯著高于E－（P＜0.05），逐漸變為與E－無顯著差異（P＞0.05，圖2b）；時間對紫花針茅凋落物的木質素含量有顯著影響（P＜0.001），內生真菌與時間對木質素含量無顯著的交互作用（P＞0.05，表1）。E+和E－紫花針茅凋落物中纖維素含量與木質素含量有相同的變化趨勢，均隨著分解時間的延長而逐漸降低（圖2c），不同的是，E+凋落物中纖維素含量始終低于E－，并在第3、8、10、12個月時達到顯著水平（P＜0.05，圖2c）；內生真菌和時間對紫花針茅凋落物纖維素含量的影響顯著，但二者之間沒有顯著的交互作用（表1）。

表1 內生真菌在不同的時間對紫花針茅凋落物重量以及全氮、木質素和纖維素含量的重復度量方差分析Table 1 Repeated measures ANOVA for the effects of endophyte at different times on litter weight，total N，lignin and cellulose contents of S.purpurea litters

圖2 E+和E-紫花針茅凋落物中全氮、木質素和纖維素含量隨時間的變化Fig.2 The change of total N，lignin and cellulose contents in E+and E-S.purpurea litters over time

E+和E－紫花針茅凋落物中木質素∶氮值均隨著時間的延長而逐漸降低（圖3a）。E+凋落物中木質素∶氮值始終高于E－，并在分解第3和6個月時達到顯著水平（P＜0.05），在此過程中，內生真菌對紫花針茅凋落物中木質素∶氮值未造成顯著影響，但是時間對其比值影響顯著，二者無明顯的交互作用（表3）。另一方面，E+和E－紫花針茅凋落物中纖維素∶氮值也隨著時間的延長而降低，但是E+凋落物中纖維素∶氮值始終低于E－，并在第3、6、10、12個月時差異顯著（P＜0.05，圖3b），內生真菌和時間對紫花針茅凋落物中纖維素∶氮值產生了顯著的影響，但二者之間無明顯的交互作用（表3）。

圖3 E+和E-紫花針茅凋落物中木質素∶氮和纖維素∶氮隨時間的變化Fig.3 The change of lignin∶N and cellulose∶N ratios in E+and E-S.purpurea litters over time

E+和E－紫花針茅凋落物中氮殘留率均隨著時間的延長而逐漸下降（圖4a），相對E－來說，在分解后期E+凋落物氮殘留率變化趨于平緩甚至有升高的趨勢。到第8和10個月時，E+凋落物氮殘留率顯著低于E－（P＜0.05，圖4a）。E+和E－紫花針茅凋落物中木質素殘留率均隨著時間的延長而逐漸下降，在此過程中，E+與E－之間差異不顯著（P＞0.05，圖4b）。纖維素與木質素殘留率有相同的變化趨勢，即E+和E－凋落物中纖維素殘留率均隨著時間的延長而降低，至第8和10個月時，E+凋落物中纖維素殘留率顯著低于E－（P＜0.05，圖4c）?？傮w而言，內生真菌顯著影響紫花針茅凋落物氮和纖維素殘留率，分解時間對于氮、木質素和纖維素殘留率均產生了顯著影響（P＜0.05），但是內生真菌與分解時間對于三者均未產生明顯的交互作用（P＞0.05，表3）。

表3 內生真菌在不同的時間對紫花針茅凋落物木質素∶氮和纖維素∶氮比值以及全氮、木質素和纖維素殘留率的重復度量方差分析Table 3 Repeated measures ANOVA for the effects of endophyte at different times on lignin∶N ratio，cellulose∶N ratio，and total N，lignin and cellulose residual rates of S.purpurea litters

圖4 E+和E-紫花針茅凋落物中全氮、木質素和纖維素殘留率隨時間的變化Fig.4 The change of total N，lignin and cellulose residual rates in E+and E-S.purpurea litters over time

3 討論

內生真菌在植物凋落物被分解之初，通過植物組織的自然衰亡而獲得優先于其他腐生真菌的定殖優勢［25］，它們可能直接降解凋落物，也可能通過拮抗、資源競爭等方式與后定殖的腐生菌相互作用，從而間接影響凋落物分解速率［26－28］。本研究中，帶內生真菌的紫花針茅凋落物具有更快的分解速率，進而，E+紫花針茅相比E－具有更短的凋落物分解周期（圖1和表1），這可能與以上因素有關。凋落物分解速率對養分轉化的速度產生直接影響，因此，內生真菌的存在加快了紫花針茅凋落物的分解，這有利于短期內對草原生態系統養分的補充［29－30］。內生真菌對一些禾草凋落物分解的影響已經被證實。Bell-Dereske等［31］發現內生真菌的侵染提高了美國沙茅草（Ammaophila breviligulata）的凋落物分解速率，本研究結果與之一致。然而，早期一些研究發現內生真菌具有降低禾草分解速率的可能，Omacini等［14］通過研究多花黑麥草（Lolium multiflorum）中的內生真菌對凋落物分解的影響，發現凋落物分解速率減少了17%；Lemons等［32］的研究也表明，與對照相比，E+處理的凋落物分解速率降低了8%。這可能主要與宿主植物的種類和共生體的生存環境等有關。Siegrist等［33］發現，盡管帶菌高羊茅（Schedonorus arundinaceus）的凋落物中具有較高的生物堿含量，也未能造成帶菌與不帶菌高羊茅凋落物的干物質損失之間的較大差異，其可能原因是高羊茅的枯黃組織中生物堿的濃度非常低，以至于不能影響到微生物分解者。Gundel等［34］的研究也表明，在初始階段凋落物體內生物堿含量越高，則其分解速率越大，但是長期觀察的結果顯示凋落物分解速率與生物堿含量之間沒有相關性。因此，生物堿可能沒有直接影響凋落物分解，但是可能參與到了初始微生物侵染凋落物的過程當中，進而影響凋落物分解速率。在與其宿主植物共生的過程當中，內生真菌也可能通過產生一些罕見的化合物而比生物堿更加直接地調控這種反應［33－34］。

凋落物質量與其分解速率密切相關，是影響其分解的內在因素，凋落物質量通常以凋落物養分含量的高低來衡量，并以各種含碳化合物（木質素、纖維素、單寧等）與養分元素（氮、磷、鉀等）的含量比值來表示，或者直接以養分含量表示［35－36］。在凋落物分解過程中，水溶性物質和容易分解的碳水化合物可快速降解，初期呈現較快的分解速率，而木質素等難分解物質不斷累積，結合成更加不易分解的高分子化合物，使得凋落物分解速率明顯降低［37］，許多研究發現，木質素在凋落物分解后期呈現凈積累的現象［38－39］。本研究中，紫花針茅凋落物木質素含量隨著分解時間的延長而逐漸降低，并且木質素∶N以及木質素殘留率也持續降低（圖2b，圖3a和圖4b），一方面可能是因為相對木本植物而言，草本凋落物木質素含量較低［40］，另一方面，本研究中凋落物分解時間僅持續一年，尚未進行到后期階段。凋落物質量損失率小于80%時認為分解處于前期階段，而大于80%處于后期階段［41－42］，本研究中E+和E－紫花針茅凋落物的質量損失率分別為51.8%和43.8%，并沒有到達木質素調控分解速率的后期階段，這可能是木質素含量持續降低的原因之一。在分解初始階段，E+紫花針茅凋落物的木質素含量顯著高于E－，而隨著分解時間的延長，二者之間差距逐漸減小，直至沒有顯著差異（圖2b），并且E+與E－紫花針茅凋落物的木質素殘留率沒有顯著差異（圖4b），表明E+紫花針茅凋落物中的木質素相比E－而言其降解速率更快，內生真菌的調節作用在凋落物分解中可能發揮了顯著作用。隨著分解過程的延長，E+和E－紫花針茅凋落物的纖維素含量均逐漸降低，同時纖維素∶N以及纖維素殘留率也持續降低（圖2c，圖3b和圖4c），可見，在紫花針茅凋落物分解過程中，纖維素也隨之逐漸被降解，這與之前的研究結果一致［39，43］。凋落物C質量被認為是決定分解的首要因子，纖維素、半纖維素作為凋落物C主要的承載者，一般認為在分解過程中，其含量也逐漸降低［39，44］。另一方面，凋落物纖維素主要是由真菌與細菌分解的，微生物分解者的數量及活性直接影響著它們的分解速率［45］，因此，內生真菌可能通過影響微生物群落進而改變紫花針茅凋落物中纖維素的降解速率［14－15］。本研究中，在分解初期，E+與E－紫花針茅纖維素含量沒有顯著差異，隨著分解時間的延長，E+紫花針茅的纖維素含量、纖維素∶N以及纖維素殘留率顯著低于E－。這也可能與纖維素酶的活性有關。許多研究表明，較高的N含量能增加纖維素酶的活性從而促進纖維素降解［46－47］，本研究發現E+紫花針茅至分解后期有更高的全N含量（圖2a），這可能部分解釋了后期E+紫花針茅凋落物纖維素的降解速率顯著高于E－的原因。

凋落物分解過程中，由于養分釋放速度慢于凋落物質量損失速率，N、P等養分元素相對含量一般會逐漸升高［48］。本研究中，紫花針茅凋落物全氮含量隨著時間的延長有上升的趨勢（圖2a），與前人的研究一致［36］。凋落物在分解過程中養分元素的遷移模式主要有：淋溶－富集－釋放、富集－釋放和直接釋放3種模式［49－50］。元素的殘留率與釋放率密切相關，所以利用化學元素殘留率的趨勢圖可分析元素在分解過程中的釋放情況，即殘留率下降表示元素在釋放，殘留率上升表示元素在富集［36，49－50］。E+和E－紫花針茅凋落物分解過程中N元素的殘留率基本呈下降－升高－下降的趨勢，表明紫花針茅的凋落物分解N元素的遷移可能呈淋溶－富集－釋放模式。其中E+紫花針茅凋落物中的N殘留率相比E－而言變化更快，且在后期，E+凋落物的N殘留率顯著低于E－（圖4a），這可能是由于E+紫花針茅分解過程中微生物活動更加強烈，對N的需求更高，這也部分解釋了E+紫花針茅凋落物相比E－具有更快的分解速度的原因。凋落物分解主要是微生物作用的過程，它們在分解過程中對N、P等元素濃度有很高的要求，因此，當凋落物含這些養分濃度較高時，微生物群落生長繁殖加速，活動加劇，分解速度加快［36，51］。這也可能是E+紫花針茅凋落物在分解過程中具有更低的纖維素殘留率的原因之一（圖4c），有研究表明，內生真菌在強化還田秸稈中有較廣泛的應用［52］，即植物內生真菌有降解纖維素的能力［53］，由此可以推測，在本研究中，內生真菌也可能通過促進紫花針茅凋落物中纖維素的降解提高凋落物分解速率。然而隨著分解時間的延長，這種優勢有減弱的趨勢，這可能主要是由于此時E+與E－紫花針茅凋落物中纖維素的殘留率均到了較低的水平，因此內生真菌的作用逐漸不明顯。

4 結論

內生真菌可以增強宿主植物紫花針茅的凋落物分解速率，縮短其分解周期，同時，隨著分解時間的延長，內生真菌不同程度地促進了紫花針茅凋落物中N元素、木質素和纖維素的降解。因此，內生真菌對于加快紫花針茅向草地生態系統的養分輸入起到積極作用。然而，本研究只觀測了短期內凋落物分解的過程，更長期的凋落物分解變化以及分解環境條件、微生物活動和內生真菌次生代謝物等因素的影響仍需要進一步研究。