GSH對鉛脅迫下多年生黑麥草生長及光合生理的影響

趙利清，彭向永，劉俊祥，毛金梅，孫振元*

（1.國家林業和草原局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京100091；2.國家開放大學，北京100039；3.曲阜師范大學生命科學學院，山東 曲阜273165；4.新疆林業科學院經濟林研究所，新疆 烏魯木齊830063）

鉛（Pb）與汞（Hg）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、砷（As）并稱“五毒”重金屬，廣泛分布于環境之中［1－2］。Pb可以通過植物根系的Ca2+通道或葉表皮的角質層小孔、氣孔器和排水器等進入植物體內，Pb在植物體內不能被降解［3－4］，累積的Pb會對植物產生毒害，如膜脂過氧化、酶失活、干擾礦質元素吸收及抑制光合作用等［5－8］。光合作用是環境脅迫最為敏感的生理過程［9］，Pb脅迫能夠使植物氣孔關閉、葉綠體結構受損、卡爾文循環中的酶失活、光合色素合成和電子傳遞受阻等，最終抑制植物生長或導致死亡［10］。因此亟待找到一種緩解Pb毒害的方法。

由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的活性三肽－谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），在重金屬解毒方面發揮了重要的作用。研究發現過表達枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的煙草（Nicotiana tabacum），在Cd脅迫下，GSH、植物螯合肽（phytochelatins，PCs）和葉綠素含量明顯高于對照，對鎘的抗性顯著增加［11］。外源GSH能夠增加植物的內源GSH含量，降低活性氧（reactive oxide species，ROS）含量，使抗氧化酶活性和細胞膜的穩定性增加，植物對Zn、Cd和Gu的耐受性增強［12－18］。相反，谷胱甘肽合成酶抑制劑丁硫氨酸－亞砜亞胺（L-Buthioninesulfoximine，BSO）能夠抑制谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使植物體內GSH和PCs含量減少，抗性降低［19－20］。目前，對GSH緩解植物重金脅迫的研究主要集中在Cd脅迫下抗氧化酶活性和細胞膜穩定性等方面，對Pb脅迫下光合作用的研究至今未見報道。

本研究以多年生黑麥草（Lolium perenne）為材料，設定CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4個處理，測定生長指標、光合色素含量、光合參數和葉綠素熒光動力學參數，研究GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草生長及光合作用的影響，以探討GSH對Pb毒害的緩解效果和生理機制，為進一步闡明GSH解毒重金屬脅迫機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 幼苗的培養

多年生黑麥草種子購自京東網“芳之葵”農資專營店，品種為‘卡特’（L.perenne‘cuttle’）。2018年5月將種子均勻地撒播于裝滿營養土的花盆中，常規養護管理。培養6周后，選生長一致的植株，洗凈根部泥土，定置于盛有9 L 1/2 Hoagland營養液的培養盆中繼續培養6周，營養液pH調為6.0，每盆3株，期間每周更換一次營養液并利用充氣泵連續充氣。

1.2 試驗處理

通過前期試驗篩選Pb處理濃度，用0、0.50、0.75、1.00、1.50 mmol·L－1Pb（NO3）2根部處理12周大幼苗，處理1周。選擇膜透性、可溶性蛋白和生長高度出現顯著差異的最低濃度0.75 mmol·L－1作為處理濃度。并且根據文獻［21－22］確定GSH和BSO的處理濃度。

試驗共設CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4個處理，每個處理3次重復。Pb（NO3）2直接加入營養液中，為避免Pb2+與營養液中的H2PO4－反應產生沉淀降低Pb效應，處理營養液采用無KH2PO4的1/2 Hoagland營養液，通過每盆噴施1次20 mL的0.2%的KH2PO4溶液補充磷和鉀元素。GSH和BSO采用葉面噴施法，噴施蒸餾水、GSH和BSO間隔0.5 h，待前者充分吸收后，再噴施后者。每天上午噴施1次，連續處理1周，處理期間利用充氣泵持續充氣。具體如下：CK）：1/2 Hoagland營養液，噴50 mL蒸餾水；Pb）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營養液，噴50 mL蒸餾水；Pb+GSH）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營養液，先噴25 mL蒸餾水，再噴施25 mL 10 mmol·L－1GSH；Pb+BSO）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營養液，先噴25 mL蒸餾水，再噴施25 mL 1 mmol·L－1BSO。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 莖葉、根長和分蘗數的測定 莖葉和根長：用刻度尺測量每一單株中最長的莖葉和根，測定3株，取平均值，精確到0.1 cm。分蘗數：以每穴（包括主莖）全部分蘗來統計多年生黑麥草的分蘗數［23］。

1.3.2 生物量的測定 用自來水沖洗植株去除表面粘附物，然后用10 mmol·L－1Na2-EDTA浸泡吸附根系表面附著的Pb2+，再用去離子水洗凈，吸干水分，稱鮮重后于105℃殺青30 min，75℃下烘干至恒重，稱干重［24］，以每穴為單位分別計算多年生黑麥草莖葉和根的生物量。根冠比=根干重/莖葉干重。

1.3.3 光合色素含量的測定 取多年生黑麥草成熟葉片0.25 g，80%丙酮提取，用分光光度計測定663、645和470 nm波長的吸光值［24］，并以Arnon（1949）法計算葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量。

1.3.4 光合參數的測定 選生長良好的成熟葉片，于上午9：00－11：00用CIRAS-2型便攜式光合儀（英國）測定多年生黑麥草的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）。試驗中所用光源為白熾燈，葉室溫度自動調控，供氣氣體流速200 mL·min－1，大氣CO2濃度450 μmol·mol－1，自動記錄，間隔時間3 s。

1.3.5 葉綠素熒光動力學參數的測定 植株在暗室中適應30 min后，用Handy PEA（Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instrument Ltd.，UK）測定葉綠素熒光動力學參數，測定光源為650 nm的紅光，光照強度為2500 μmol·m－2·s－1的飽和光強，熒光信號的記錄時程為2 s，解析從葉綠素熒光動力學曲線中得到的主要熒光參數，每個重復測定3次。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0進行數據的統計分析，最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗P＜0.05水平上的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草莖葉長、根長及分蘗的影響

與對照組比較，Pb處理下多年生黑麥草莖葉長、根長和分蘗數分別顯著降低了36.7%、41.9%和37.3%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，莖葉長、根長和分蘗數較Pb處理組均顯著增加，但仍然顯著低于對照。與Pb處理組比較，Pb+BSO處理下，莖葉長略微增加，根長和分蘗數稍有下降，但均無顯著差異（圖1）。

圖1 外源GSH和BSO誘導Pb脅迫下多年生黑麥草的莖葉長、根長及分蘗數Fig.1 Shoot length，root length and tiller number of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.2 GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草生物量的影響

與對照組比較，Pb處理下多年生黑麥草莖葉鮮重、干重、根的鮮重和干重及根冠比分別顯著降低了52.1%、37.9%、65.7%、41.7%和7.3%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，較Pb處理組的莖葉鮮重、干重和根的鮮重、干重以及根冠比均顯著提高，但除了根冠比之外，其他指標仍顯著低于對照組。Pb+BSO處理較Pb處理組，莖葉鮮重和干重以及根干重均顯著下降，但根冠比顯著升高。這表明Pb脅迫抑制了植物的生長，而且對根的抑制大于莖葉，噴施GSH能夠緩解Pb對多年生黑麥草生長的抑制作用，BSO則加劇了Pb的抑制作用（表1）。

表1 外源GSH和BSO誘導Pb脅迫下多年生黑麥草的生物量及根冠比Table 1 Plant biomass and root-shoot ratio of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.3 GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草光合色素的影響

Pb處理下，多年生黑麥草葉片葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量較對照分別下降了8.6%、12.2%和9.6%，均達到了顯著水平（P＜0.05）。Pb+GSH處理較Pb處理組，葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量均顯著增加。Pb+BSO處理下，類胡蘿卜素的含量顯著低于Pb處理組（表2）。

表2 外源GSH和BSO誘導Pb脅迫下多年生黑麥草的葉片光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.4 GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草光合參數的影響

Pb、GSH和BSO處理下多年生黑麥草葉片光合參數發生了不同的變化，單一Pb處理下，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度比對照分別顯著降低了64.3%、51.5%和67.0%，胞間二氧化碳濃度顯著增加了5.2%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，較Pb處理組，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間二氧化碳濃度均顯著增加。Pb+BSO處理下，較Pb處理組，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間二氧化碳濃度均呈現下降趨勢。這表明Pb脅迫抑制了多年生黑麥草的光合作用，外源GSH可緩解Pb脅迫作用，而BSO具有與GSH相反的功能（表3）。

表3 外源GSH和BSO誘導Pb脅迫下多年生黑麥草的葉片光合參數Table 3 Photosynthetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.5 GSH對Pb脅迫下多年生黑麥草葉綠素熒光動力學參數的影響

單一Pb脅迫下，Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo和PIABS較對照組均顯著降低（P＜0.05），下降幅度最大的是PIABS，達到35.98%，最小的是Fv/Fm，只有1.93%，這表明Pb對植物的整體性能影響最大。Pb+GSH處理下，各項指標較Pb處理都有所增加，增幅最大的是PIABS，為26.1%。Pb+BSO處理下，與Pb處理組相比，各項指標變化趨勢不統一，但均沒有顯著差異（表4）。

表4 外源GSH和BSO誘導Pb脅迫下多年生黑麥草的葉綠素熒光動力學參數Table 4 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

3 討論

植物的生長狀態可以直接反映出受脅迫的程度，因此是評估抗逆性的重要指標［25］。前人研究表明，Pb脅迫下植物株高和生物量降低，分蘗數減少，生長受到抑制［7，26－27］。同樣，Pb脅迫下多年生黑麥草的莖葉長、根長、分蘗數和生物量均顯著降低，噴施GSH后，莖葉長、根長、分蘗數和生物量都顯著增加，這可能是GSH調節光合作用，誘導生長素合成酶基因的表達，保證了部分細胞正常分裂，緩解Pb脅迫對幼苗生長的抑制［16，28］。相反，Pb脅迫下多年生黑麥草噴施BSO后，根長、分蘗數和生物量都呈下降趨勢，生長受到嚴重的抑制，這與在東南景天（Sedum alfredii）上的研究結果相符［29］。

葉綠素負責光能的吸收、傳遞和轉換，是植物進行光合作用的物質基礎［30］。重金屬離子能夠取代植物葉綠體蛋白質中的Fe2+、Zn2+、Mg2+或與功能基團－SH結合，致使葉綠體蛋白中心離子組成發生改變而失活，導致葉綠素含量和光合能力下降［31］，本研究與前人報道一致，Pb處理下多年生黑麥草葉綠素含量顯著降低。外源GSH能夠增加Cd、Cu脅迫下水稻（Oryza sativa）和海洲香薷（Elsholtzia haichowensis）的葉綠素含量［15，32］，本研究中GSH處理后，多年生黑麥草葉綠素含量顯著增加，可能是由于外源GSH降低了Pb與SH結合或對葉綠素中心離子的取代，保護了光合電子鏈中酶的活性，從而保證了葉綠素的合成。

類胡蘿卜素除了具有吸收和傳遞光能功能外，還可以猝滅激發態的葉綠素，避免吸收多余的能量對光系統造成傷害［33］。低濃度重金屬促進小白菜（Brassica chinensis）類胡蘿卜素的合成，相反，高濃度能抑制其合成［34］。Pb處理后多年生黑麥草類胡蘿卜素沒有顯著變化，可能是由于植物種類和處理濃度不同的原因。GSH處理后也沒有顯著變化，而BSO處理后顯著低于Pb處理，這證明了當類胡蘿卜素處于正常水平時，增加GSH對其合成沒有促進作用，而減少GSH會嚴重影響合成。

氣孔限制和非氣孔限制是導致Pn降低的兩個因素，Pn、Gs和Ci同時下降是氣孔因素影響，否則是非氣孔因素［24］。本研究中Pb脅迫下Pn、Gs下降，而Ci升高，說明多年生黑麥草Pn下降是非氣孔因素引起的，這與前人在紫穗 槐（Amorpha fruticosa）上 的 研 究 結 果 一 致［35］。Wang等［36］研 究 發 現 外 源GSH能 夠 緩 解 鎘 對 兩 種 大 麥（Hordeum vulgare）Pn的抑制，同樣，多年生黑麥草噴施GSH后Pn也顯著增加。噴施BSO后Pn降低，與Mariana等［20］在大豆（Glycine max）上的研究結果一致。

與“表觀性”的氣體交換參數相比，葉綠素熒光動力學參數可更靈敏地反映出植物葉片光合機構性能的變化［37］。本 研 究 中，Pb脅 迫下多年生黑 麥 草 葉 片Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm及PIABS均 顯 著下降，類 似 結 果 在 百 喜草（Paspalum notatum）上也得到了證實［38］。Fo下降表明捕光天線系統受到了損傷［39］，Fm、Fv/Fm的下降表明光合電子傳遞能力和反應中心內光能轉換效率下降。Fv/Fo和PIABS的下降意味著PSⅡ的潛在活性和整體性能都在下降。Pb脅迫后噴施GSH，增加了PIABS，表明GSH能夠提高多年生黑麥草PSⅡ的整體性能，究其原因，可能與葉綠素含量變化相關。

4 結論

Pb脅迫降低了多年生黑麥草葉綠素含量，損傷了捕光天線系統，阻礙了光合電子傳遞和光能轉換，從而降低了Pn，影響了光合作用，最終抑制了植物的生長；外源噴施GSH能夠緩解多年生黑麥草Pb脅迫作用，而BSO具有與GSH相反的功能，加劇了Pb脅迫的傷害。