植物內生腸桿菌對狗牙根耐鹽性的調控研究

趙欣桐，陳曉東，李子吉，張巨明，劉天增

（華南農業大學林學與風景園林學院，廣東省草業工程技術研究中心，廣東廣州510642）

草坪對于目前的生活來說是建設人類文明的重要組成部分，對生態環境的保護與改善起到良好作用。但目前由于氣候變化和水資源的不合理利用，加劇了土壤鹽漬化程度，致使草地資源退化嚴重，嚴重影響農牧業的發展和生態環境建設［1］。草坪是陸地的主要生態系統之一，對改善生態環境有著重要作用［2］。因此，培育或篩選合適的耐鹽草種或改善鹽堿地環境對草坪草的建植與發展具有重要意義。

鹽脅迫是目前限制植物生長的主要逆境因子之一，極大地影響了植物的生長［3］，研究表明，鹽堿環境會限制植物生長，植物生長的不同時期對鹽堿的敏感程度不同，其中種子萌發期最為敏感，鹽濃度越高，種子萌發受抑制程度越高［4－5］。而種子的萌發之所以會率先受到抑制，是因為在該階段種子對外界環境脅迫的抗性和耐性最弱［6］。有研究［7］表明，土壤中鹽分會通過滲透調節與離子效應等途徑影響種子的萌發，導致植物的水分利用效率降低、氣孔關閉、葉綠素降解，使草坪草生長發育受阻，并直接影響草坪成坪質量。李源［8］的研究以海濱雀稗（Paspalum vaginatum）“Salam”和“Seaspray”、馬尼拉結縷草（Zoysia matrella）、結縷草“蘭引三號”（Zoysia japonica）和狗牙根（Cynodon dactylon）“Tifway”5種暖季型草坪草為試驗材料，表明鹽脅迫會降低草坪草的坪用質量和葉綠素含量，還會引起植物的損傷，限制其生長發育［9－10］。Munns等［11］的研究表明，鹽脅迫對植物造成損害是由于高濃度鹽離子（Na+和Cl－）產生的高滲透壓。此外，鹽脅迫還會造成植物根系過度積累單一離子（如Na+）形成單鹽毒害，并干擾其他離子（如K+、Ca2+）的吸收與代謝，破壞植物體內離子的動態平衡［12］，降低植物根系的吸水能力，致使草坪草的生長受損［13］。因此土壤鹽漬化逐漸成為影響草坪發展的主要問題之一［14－15］。

植物內生細菌是一類在健康植物組織中存活而不會導致宿主植物表現出明顯感染癥狀的細菌［16］。內生細菌與宿主植物之間互利共生，幾乎所有植物中都有內生細菌，并且與植物在不同環境中協同進化［17］，增強植物對病害、鹽堿、重金屬等的抗逆能力［18－19］，并引發各種脅迫條件下的系統抗性。這些有益內生菌被稱為植物促生細菌（plant growth promoting bacteria，PGPB），其多存在于根際和葉際［20］。Mayak等［21］研究推測在一定鹽脅迫下，接種內生細菌可促進植物對礦質營養元素的吸收，改變植物體內離子平衡，并增加植物對水分的吸收和利用能力。此外，促進植物生長的細菌還可以作為植物刺激劑或生物肥料，因為其有助于維持土壤肥力，并且是可持續農業中農藥和其他化學肥料的有利替代物［22］。

狗牙根為禾本科狗牙根屬多年生草本植物，為世界三大暖季型草坪草之一，因具有繁殖力強、抗旱、抗鹽堿、耐踐踏、色澤好等優點，可作為重要的牧草、草坪草及水土保持種質資源，被國內外廣泛用于建植運動場、公園及固土護坡［23－25］。目前，我國草坪和綠地面積在持續增加，但是由于水資源緊缺，使用再生水和非生活用水進行灌溉已經不可避免。然而再生水中含有大量的鹽分離子，長期使用再生水灌溉草坪綠地必然導致土壤含鹽量上升，進而影響草坪質量和使用年限。目前狗牙根耐鹽性研究多為培育新品種及篩選新品系［24］，而植物內生菌有利于植物緩解鹽脅迫，其具有巨大的應用潛力。本研究以植物內生腸桿菌（Enterobacter）為研究對象，探討其對狗牙根種子萌發、生長及耐鹽性調控的生理機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

狗牙根種子選用從天津百綠國際草業有限公司所購的“Common”品種。內生細菌Enterobacter ludwigii（B30）和Enterobacter bugandensis（B14）由本課題組前期從耐鹽植物海濱雀稗中分離篩選獲得，現保存于華南農業大學草業科學實驗室低溫冰箱中。

1.2 內生細菌的菌懸液配制

試驗于2019年10月－2020年1月于華南農業大學實驗室內進行。將低溫保存的B30和B14菌株活化，后在營養肉湯液體培養基中加入2 mL B30菌液作為單一菌液，在營養肉湯液體培養基中分別加入B30和B14各1 mL作為混合菌液，然后在200 r·min－1、30℃的搖床中震蕩培養48 h，測定菌液細菌細胞密度OD600=0.8時待用。本研究前期的菌株耐鹽能力測試發現，菌株B30的耐鹽能力較強，菌株B14的耐鹽能力很弱，而混合菌液（B3014）耐鹽能力高于B30菌液且無拮抗作用，故本試驗中沒有配制B14菌液接種狗牙根種子和幼苗。

1.3 狗牙根種子萌發試驗

選取籽粒飽滿的狗牙根種子用75%酒精表面消毒60 s，無菌水沖洗3次，在無菌水中浸泡24 h。將100粒種子置于直徑為9 cm鋪有雙層濾紙的培養皿中，用移液槍分別移取配制好的B30菌液和B3014混合菌液，浸泡種子，對照組接種等體積的液體培養基，每個處理5次重復，置于恒溫培養箱中培養。接菌處理24 h后，在培養皿中加入150 mmol·L－1的NaCl溶液進行鹽脅迫處理，從處理第3天開始，每天觀察并統計發芽率，第14天后統計種子發芽率并用游標卡尺測量狗牙根幼苗的胚根和胚芽。

1.4 狗牙根盆栽試驗

狗牙根種子經75%的酒精表面消毒后，將100粒籽粒飽滿的狗牙根種子均勻播種于口徑10 cm，高9 cm的方形花盆中，播種深度0.5 cm，底部鋪設白色紗網，土壤基質由泥炭和河沙1∶1配置而成，播種后置于人工氣候箱中（白天30℃14 h，晚上26℃10 h，相對濕度80%）培養。育苗期間早晚各澆一次水，保持土壤濕潤，待出苗后逐漸減少澆水次數，以正常的草坪管理方式養護至成坪，此期間保證各處理生長條件及養護方式處于同一條件。待狗牙根成坪后，向對應處理盆栽中澆灌40 mL對應菌液（OD600=0.8），分4次進行，每次10 mL，每次間隔24 h，空白對照澆灌等量的培養基［26］。每個接種處理設置5次重復，澆灌菌液1周后，對其進行鹽脅迫處理。鹽脅迫處理采用鹽水澆灌方式，每次澆灌50 mL NaCl溶液，隔天澆灌一次。為避免鹽濃度過高對其造成損傷，NaCl溶液濃度從50 mmol·L－1開始逐漸遞增至200 mmol·L－1的最終濃度。在達到最終鹽濃度后的5、10、15 d取樣測定以下指標。

1.5 測定內容與方法

采用目測打分法測定草坪質量，8～9分很均勻、6～7分較均勻、4～5分均勻、2～3分不均勻、1分極不均勻。每個處理由3位觀測人員獨立打分，計算平均數為評分結果。

苗長與根長測定：鹽處理15 d后，取不同處理的完整植株5株，除去葉片灰塵，洗凈根系基質土，將其分為地上部分與根系部分，用游標卡尺測量。

生物量測定：鹽處理15 d后，取不同處理的完整植株5株，除去葉片灰塵，洗凈根系基質土，將其分為地上部分與根系部分，然后放置于烘箱中，105℃殺青15 min，80℃烘干24 h后稱取干重。

相對電導率測定：取剪碎并混勻的葉片0.1 g，分別置于5 mL去離子水刻度試管中，蓋上玻璃塞置于室溫下浸提12 h，測定外滲溶液電導率C1，之后將試管放入沸水中水浴15 min，冷卻至室溫后搖勻并測定外滲溶液電導率C2［27］。相 對電導率=C1/C2×100%。

葉片相對含水量測定：取剪碎并混勻的葉片0.1 g，除去表面灰塵，稱其鮮重，常溫浸泡24 h后用吸水紙擦干葉片，稱重得飽和鮮重，然后置于烘箱中，105℃殺青15 min，80℃烘干24 h后取出稱其干重［28］。葉片相對含水量=［（鮮重－干重）/（飽和鮮重－干重）］×100%。

葉綠素含量測定：取0.1 g樣品浸泡在裝有10 mL丙酮/無水乙醇（體積比1∶1）溶液的帶蓋10 mL離心管中，遮光處理24 h，至葉片發白。以空白溶劑作為對照，分別在波長645和663 nm處測定吸光度［29］。

式中：C表示總葉綠素濃度（mg·mL－1），V表示測試液體積（mL），m表示樣品重量（g）。A表示吸光值。

葉片K+、Na+含量測定：取不同處理的葉片鮮葉，置于烘箱中，烘干至恒重后磨成細碎的粉末，取0.5 g加入30 mL硝酸－高氯酸（5∶1）混合酸，瓶口放一只彎頸漏斗，靜置過夜。第2天消煮時保持微沸狀態，這時放出大量煙霧（NO2）。當棕色氣體消失，升高爐溫使SiO2脫水至冒白煙為止。冷卻后，加入20 mL去離子水，過濾到150 mL容量瓶內，用熱的1%鹽酸溶液洗滌三角瓶和濾渣，直至無Fe3+反應后定容搖勻，作為待測溶液［30］。用空氣－C2H2火焰，分別在766.5和589.0 nm處測定鉀和鈉含量。

1.6 數據分析

采用SPSS 19.0進行差異顯著性分析（Duncan，P＜0.05），利用Microsoft Excel 2010進行數據整理和作圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根種子萌發的影響

在150 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌對狗牙根種子萌發有顯著的促進作用（P＜0.05）。與CK相比，接種混合菌液B3014的種子發芽率提高了8.7%，而接種單一菌液B30的種子發芽率提高了5.0%。在接菌處理中，接種混合菌液B3014對種子萌發的促進效果顯著高于接種單一菌液B30（P＜0.05）（圖1）。

圖1 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根種子萌發的影響Fig.1 Seed germination of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.2 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根幼苗的影響

在鹽脅迫下，接種內生細菌對狗牙根胚根和胚芽的長度均有顯著的促進作用（P＜0.05）。與CK相比，接種混合菌液B3014的胚根和胚芽分別增加了2.01%和0.65%，而接種單一菌液B30的胚根和胚芽分別增加了0.38%和0.27%。在接菌處理中，接種混合菌液B3014的胚根增加量顯著高于接種單一菌液B30（P＜0.05），但胚芽的增加量差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

圖2 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根幼苗的影響Fig.2 Seedling growth of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.3 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根草坪質量和葉綠素含量的影響

在200 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌能顯著提升狗牙根草坪綜合質量和葉片葉綠素含量（P＜0.05）（圖3）。隨著鹽脅迫處理時間的增加，草坪綜合質量和葉綠素含量均呈現逐漸下降趨勢。雖然接種混合菌液B3014和單一菌液B30的草坪綜合質量也呈下降趨勢，但與CK相比，下降幅度較小，而在兩個接菌處理中，接種混合菌液B3014更能減緩草坪質量的下降。在鹽脅迫下，通過接種混合菌液B3014和單一菌液B30在很大程度上提升了狗牙根葉片葉綠素含量，而接種混合菌液B3014對葉片葉綠素含量的提升高于接種單一菌液B30。

圖3 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根草坪質量和葉綠素含量的影響Fig.3 Turf quality and chlorophyll content of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.4 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根苗長和根長的影響

在200 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌能顯著提升狗牙根植株的根長與苗長（P＜0.05）（圖4）。與CK相比，接種混合菌液B3014的植株根長與苗長分別提升了0.46%和0.20%。而接種單一菌液B30的植株根長與苗長分別提升了0.14%和0.10%。在接種菌液的處理中，接種混合菌液B3014對植株根長與苗長的促進效果顯著（P＜0.05）高于接種單一菌液B30。

圖4 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根根長和苗長的影響Fig.4 Shoot and root length of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.5 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根生物量的影響

在200 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌會顯著提升狗牙根的生物量（P＜0.05）。與CK相比，接種混合菌液B3014對狗牙根地上、地下生物量分別提升了0.31%和0.24%。而接種單一菌液B30對狗牙根地上、地下生物量分別提升了0.56%和0.31%。在接種菌液的處理中，接種混合菌液B3014對狗牙根生物量的提升效果顯著（P＜0.05）高于接種單一菌液B30（圖5）。

圖5 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根生物量的影響Fig.5 Root and shoot biomass of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.6 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根相對含水量和細胞膜透性的影響

在200 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌會顯著提升狗牙根葉片的相對含水量，降低細胞滲透率（P＜0.05）。隨著鹽脅迫時間的延長，狗牙根葉片的相對含水量均呈降低趨勢，與CK相比，接種內生細菌會使葉片保持較高的相對含水量，且接種混合菌液B3014的作用效果高于接種單一菌液B30（P＜0.05）。與此同時，狗牙根葉片的細胞滲透率在不斷地增加，但與對照相比，接種內生細菌會顯著降低細胞滲透率（P＜0.05）。在鹽處理5 d后，接種混合菌液B3014對狗牙根葉片細胞滲透率的降低效果顯著高于接種單一菌液B30（P＜0.05），但在鹽處理10、15 d后，接種混合菌液B3014與接種單一菌液B30相比，葉片細胞滲透率的降低效果差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖6 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根相對含水量和電導率的影響Fig.6 Relative water content and electrolyte leakage of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

2.7 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根鈉、鉀含量的影響

在200 mmol·L－1鹽脅迫下，接種內生細菌顯著降低狗牙根鈉離子的積累，并增加鉀離子的含量（P＜0.05）。與CK相比，接種混合菌液B3014后狗牙根葉片鈉離子含量降低了21.54%，而鉀離子含量提升了9.79%。接種單一菌液B30后狗牙根葉片鈉離子含量降低了12.11%，而鉀離子含量提升了4.53%。但在接種菌液的處理中，接種混合菌液B3014對葉片鈉含量的降低作用強于接種單一菌液B30，同時，接種混合菌液B3014對葉片鉀含量的提升效果也強于接種單一菌液B30（圖7）。

圖7 鹽脅迫下內生細菌對狗牙根鈉、鉀含量的影響Fig.7 Na+and K+content of bermudagrass inoculated with endophytic bacteria under salt stress

3 討論

種子萌發期是對鹽脅迫最為敏感的時期，種子的萌發不但影響種子的播種質量，還會影響萌發后草坪草的生長發育［31］，進而影響狗牙根的成坪質量。植物內生菌作為一種促進植物生長發育、增強宿主抗逆性的天然資源，會增強鹽脅迫下植物種子的萌發［32］。Mauricio等［33］與王楠等［34］的研究表明植物內生促生細菌不但可以促進種子萌發，還能促進草坪草的生長。本研究中，接種內生細菌后，狗牙根種子萌發率得到顯著提升，幼苗的胚根長與胚芽長也得到了提升。接種菌液保證了狗牙根在鹽脅迫條件下正常的生長發育，減緩鹽脅迫下植株生長量和生物量受到的抑制，進而保證狗牙根的草坪質量。

鹽脅迫條件下，植物生理生化過程會遭到破壞，使土壤中積累大量鹽離子，致使土壤滲透勢增高，造成植物缺水。為了緩解鹽脅迫對植物帶來的損傷，植物會通過離子轉運機制、滲透調節機制和活性氧清除機制及三者間相互作用、協同調節來緩解鹽脅迫對其產生的毒害作用［35］。質膜是活細胞與外界環境之間的連接屏障，當細胞受到外界脅迫壓力時，會導致細胞膜透性增大，進而損傷細胞膜的正常生理功能和代謝作用［36］。有研究推測，在一定的鹽脅迫下，施加內生細菌可以促進植物對礦質營養元素的吸收，改變植物體內離子平衡，增強植物對水分的吸收和利用，減緩植物在鹽脅迫下因水分吸收不徹底所帶來的負面影響［21，37］。在本試驗中，接種內生細菌后，鹽脅迫下葉片相對含水量顯著提升，而細胞膜透性顯著降低，維持了植物細胞的穩定。同時，葉片葉綠素含量在鹽脅迫下受抑制程度減弱，保證了在鹽脅迫條件下狗牙根的正常光合代謝。

土壤中的離子濃度處于動態平衡狀態，任何一種離子濃度的升高對其他離子的吸收均會造成影響。植物在鹽漬環境中是否能維持植物體內的離子平衡，對其在鹽脅迫下是否能正常生長起到至關重要的作用［38］。K+是植物生長的必需營養元素［39］，在高鹽濃度土壤中，Na+濃度的升高，對K+的吸收會造成拮抗［40］，而將植物吸收的Na+排出體外和保持K+含量的能力是植物抗鹽的重要特性［41］。李靜［42］研究發現，K+外流與抗鹽能力呈負相關，因此可以通過增強植物細胞內K+含量來提升植物耐鹽性。本研究中，在鹽脅迫條件下，接種植物內生細菌后，狗牙根葉片中的K+增加，說明接種內生細菌后，植株通過增加K+含量來減少細胞內離子外泄并增強狗牙根的耐鹽能力。在許芳芳等［43］的研究中發現施加EnterobacterFYP1101可以降低100 mmol·L－1鹽脅迫條件下小麥（Triticum aestivum）幼苗中Na+的吸收。本研究中，鹽脅迫條件下接種內生細菌后，植株Na+含量明顯降低，說明植物內生細菌對狗牙根葉片Na+的積累會產生抑制作用，以此來幫助狗牙根減緩Na+的毒害。

植物促生細菌（PGPB）可以幫助植物在不同環境中獲取營養，并直接或間接的促進植物的生長［44］。而耐鹽的PGPB可以很好地幫助植物克服鹽脅迫，在鹽脅迫條件下，接種內生細菌不但可以促進植物的生長，還可以提高植物的抗性。Diskit等［45］的研究表明腸桿菌屬的部分菌株可以通過提升鹽脅迫下植株葉片內葉綠素含量來促進植物生長并提高植株的抗逆性，本試驗結果與此一致。在本研究中，鹽脅迫下接種混合菌液B3014對狗牙根植株的緩解效果優于接種單一菌液B30，出現此現象的原因可能是在植物根際存在微生物群落，在此層面，植物與微生物群落之間關系密切，產生協同作用，共同減緩鹽脅迫對狗牙根植株帶來的損傷。植物促生內生細菌B14和B30雖均為耐鹽菌株，但菌株B30的耐鹽強度優于菌株B14，本研究中接種單一菌株的作用效果小于接種混合菌株的原因可能是菌株B14可以加強菌株B30對狗牙根植株內鉀離子的吸收，并減少鈉離子的積累，維持植物體內的離子平衡來加強鹽脅迫下狗牙根的耐鹽能力。

4 結論

從整體試驗結果來看，在種子萌發期間，接種混合菌液B3014會顯著提升狗牙根種子的發芽率，增加胚根及胚芽的長度。在成坪期，接種混合菌液B3014會大幅度提升草坪質量，并提升狗牙根葉片葉綠素含量，葉綠素含量的保證會加強狗牙根光合系統的活性，保證其進行正常的光合代謝。還會提高狗牙根生物量的積累，促進狗牙根的生長，保證在鹽脅迫條件下株高與根長的增長量。在鹽脅迫期間，通過接種混合菌液B3014，會使狗牙根葉片保持正常的含水量，并減少細胞膜破損程度，使植物細胞可以進行正常的代謝作用。而通過測定狗牙根植株內鈉離子和鉀離子含量也證明了，接種混合菌液B3014后，鉀離子含量的上升，可以增強狗牙根體內的滲透調節，降低狗牙根植株內鈉離子的積累，緩解了鹽脅迫下鈉離子對狗牙根的毒害。綜上所述，接種混合菌液B3014可以更好地減緩鹽脅迫下對狗牙根生長的損傷，使狗牙根在生長過程中保持一個穩定狀態，因此可以通過施加帶有內生細菌的生物肥料，來減緩鹽漬土壤對狗牙根帶來的損害并減少化學殘留對環境造成的不良影響。