SSR在水產養殖中的研究進展

王寧 周金旭 徐浩 王秀利

摘 要：為深入了解簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標記在水產養殖中的應用情況，為今后開展水產養殖動物的分子標記輔助育種，綜述了SSR的開發方法以及SSR在種群的遺傳多樣性分析、數量性狀的定位、DNA指紋圖譜構建、遺傳連鎖圖譜構建等方面的研究進展。SSR分子標記在水產養殖動物的種質鑒定、遺傳距離分析、分子標記輔助育種等方面具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：SSR;分子標記;水產養殖

SSR即簡單重復序列，也稱作微衛星DNA （ Microsatellite DNA）或是短串聯重復序列 （Short tandem repeats）[1]。因為SSR具有豐富的多態性，使其成為繼單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）之后最有用的用于遺傳研究的DNA標記之一[2]。現階段已經開發多種分子標記手段[3]，如單核苷酸多態性標記（SNP）、限制性片段長度多態性標記（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態DNA標記（Random amplified polymorphic，RAPD）、擴增片段長度多態性標記（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微衛星標記（SSR）等，且已廣泛應用于動植物遺傳研究中[4-8]。SSR具有其他分子標記不可比擬的優勢[9]，使其在動物分子標記育種中具有很高的研究和應用潛力。近年來， SSR標記技術作為重要的分子標記育種技術，已廣泛應用于水產養殖行業中[10-12]。本文對SSR在水產養殖領域的研究和應用進展進行了綜述。

1 SSR簡介

1.1 SSR的定義

SSR是指含極短單位（通常小于10 bp）串聯重復序列的基因組DNA片段，通常重復相對較少的次數，以不同的長度散布在真核生物基因組中[1]。SSR標記技術是基于特定引物PCR擴增的一項分子標記技術，屬于第二代分子標記技術，由Litt和Luty最早在1989年研究心肌肌動蛋白基因時提出[13]。其通常由1～6 bp串聯重復的核苷酸為核心序列，例如（AC）n、（GT）n、（AT）n和（ATT）n等，n為核心序列的重復次數，一般為10～60次不等。由于其核心序列的重復次數不同和核心序列不完全相同，使SSR具有豐富的多態性。因為SSR兩端的單拷貝序列具有保守性，所以可根據堿基互補配對原則設計出特異性引物，運用PCR技術對含有SSR的基因組DNA序列進行擴增，擴增的目的片段可通過電泳等方式分析其多態性[14-16]。

1.2 SSR的優缺點

鑒于前文所述SSR的構成特點，SSR作為標記技術在開發和利用中展現出明顯的優缺點。SSR的優點在于：（1）呈孟德爾共顯性遺傳，不易被選擇淘汰掉。（2）隨機散布在真核生物的基因組中，數量豐富。如Beckman等[17]研究發現人類基因組中大約每6 kb就存在一個SSR位點，且SSR既存在于編碼區也存在于非編碼區。 （3）高效，只需少量DNA就可以進行PCR擴增分析鑒定分析[18]。（4）其核心序列種類多，重復程度多樣，使其具有高度的多態性。（5）種屬間部分物種可以共用，具有良好的通用性。如楊璞等[19]用蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）的SSR引物在櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的基因組DNA上擴增出了相應的SSR位點。（6）不同的SSR位點由不同的引物序列決定，有利于更高效、更優化的引物開發。

然而現階段SSR在使用過程中也會展現出一些缺陷：對于基因序列完全未知的物種而言，SSR位點引物開發是一大難點，這需要構建基因組文庫或者全基因組測序，需要花費大量的物力、人力以及時間;SSR位點會存在一些突變，比如起始位點的DNA會發生替代，插入和缺失導致非等位基因的出現[20];SSR多態性檢測依賴PCR擴增效果，PCR擴增效果的好壞會受諸多因素影響，例如引物3`端的堿基發生突變會嚴重影響PCR的擴增效率[21]。為了避免這些問題的發生，研究者在實驗過程中必須采取嚴格的實驗手段以開發更加經濟高效的SSR引物。

2 SSR的開發方法

目前，已經建立了多種SSR開發方法，包括構建基因組文庫篩選法[22]、濾膜富集法[23]、磁珠富集法[24]、基于PCR技術開發SSR標記法[25]、數據庫篩選法[26]以及基于高通量技術開發SSR標記[27]等方法。構建基因文庫篩選法是通過提取、分離、純化得到DNA片段，連接載體后轉化到大腸桿菌中構建基因組文庫，利用放射性同位素或其他發光化學物質標記的SSR探針與基因組文庫中的DNA雜交，對陽性克隆結果進行測序并設計SSR引物[22]。此方法雖然工作量大，但是操作流程簡單，是最經典的傳統方法。濾膜富集法和磁珠富集法是基于基因文庫篩選法的基礎上開發的新方法，他們都是在構建基因文庫之前利用SSR探針將基因組文庫DNA片段進行富集，以此來提高陽性克隆的獲得率。但是這兩種方法依然需要構建基因組文庫，操作過程較復雜。基于PCR技術開發的方法避免了構建基因文庫，但是技術要求高，實驗條件苛刻，實際應用較為困難。數據庫篩選法就是利用核酸序列數據庫查詢已公布的SSR標記，同樣避免基因組文庫的構建，利用數據庫獲得SSR標記方便又快捷，但是篩選出的SSR標記多態性不如構建基因文庫方法篩選出的SSR標記多態性好。高通量測序技術，即下一代測序技術，該技術可同時對數百萬個DNA分子進行測序，其效率要遠高于傳統的Sanger測序法[28]。如岳華梅等[29]采用Illumina高通量測序技術，對興國紅鯉（Cyprinus carpio var.singuonensis）垂體和性腺等組織進行轉錄組測序分析，篩選出了多態性較好的9個SSR標記。這9個SSR位點可能與功能基因相關，從而可為后續遺傳圖譜構建、QTL定位等提供有力支持。上述的SSR標記開發方法各有自己的優勢和不足，在研究中可根據自己的目的和狀況來選擇最適合自身的SSR標記的開發方法。

3 SSR在水產養殖方面的應用

3.1 種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和。但一般實驗研究的是種內的遺傳多樣性，即種內個體之間或種群內不同個體的遺傳變異總和。分析某一野生群體的遺傳多樣性，有助于對該種群種質資源的評估，對于以后作為經濟動物引進和培養具有重要的指導意義。對于養殖群體的遺傳多樣性分析，能夠對其種質資源進行分析，評價是否發生種質資源退化，從而通過引進優良原種等方式改善該養殖區域的養殖狀況。遺傳多樣性是組成生物多樣性的重要部分，SSR作為重要的分子標記，可用于檢測個體基因型，統計群體的等位基因數目和頻率，并利用分子遺傳學和統計學原理，計算種群的遺傳變異程度，初步評價種群的遺傳多樣性[30]。

近年來，SSR分子標記已經在多種水產動物的群體遺傳多樣性研究中發揮了重要作用。如慎佩晶等[31]對來自以色列、緬甸、孟加拉、核心種（南太湖2號）和泰國的5個羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）群體中的127個樣品進行了遺傳多樣性分析，共檢測出70個微衛星位點。并利用這些SSR作為分子標記，經統計和遺傳分析得出這些群體的遺傳相似數在0.367 4～0.796 5之間，平均遺傳相似系數為0.554 1;親緣關系最近的兩群體為孟加拉群體和核心群體，其相似系數為0.796 5，而以色列和孟加拉這兩個群體的相似系數為0.367 4，親緣關系也最遠。總體而言實驗的所有種群的遺傳多樣性都比較高，為以后羅氏沼蝦的雜交育種提供了理論依據。譚云飛等[32]運用微衛星標記技術對我國長江中下游流域的13個克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）野生群體進行了遺傳多樣性和遺傳結構分析，對其等位基因數（Na）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、多態性信息含量（PIC）、Hardy-Weinberg平衡指數與遺傳距離等做了分析，結果發現克氏原螯蝦在我國已初步形成3個不同的遺傳群體，有向不同遺傳群體分化的趨勢，并建議要做好這3個種群的保種工作，防止發生種質退化。趙彥花等[33]對珠江口海域的黃唇魚（Bahaba flavolabiata） 群體進行了遺傳多樣性分析，對黃唇魚的微衛星位點進行擴增開發，通過毛細管電泳檢測（Capillary electrophoresis，CE），并進行遺傳分析計算得出黃唇魚種群遺傳多樣性水平并沒有隨其種群數量的減少而下降，依然保持較高的水平，為以后的黃唇魚遺傳學研究提供了初步的分子基礎。Du等[34]為了解日本對蝦（Penaeus japonicus）種質資源現狀，利用形態計量學分析和熒光微衛星標記對5個日本對蝦群體的遺傳多樣性進行了分析。結果表明雖然這5個種群都具有較高的遺傳多樣性，但是地理距離越近的種群，其相似性越高。該結果意味著棲息地條件、環境條件和人類活動可能是造成日本對蝦種群遺傳變異的主要原因。通過遺傳多樣性分析可了解種群的遺傳結構、生活狀況和分析進化歷程，才能提出合理的保護措施。綜合上述研究實例可見，SSR作為理想的遺傳標記，已廣泛應用到水產動物遺傳多樣性研究中，推動了保種工作的進展。

3.2 數量性狀的定位

數量性狀的定位是指分析某一數量性狀與染色體上某一DNA標記的關系，從而估計遺傳效應[35]。因SSR具有極高的穩定性，使其成為能被利用進行數量性狀定位的重要分子標記之一。對于數量性狀的定位有助于優良性狀的篩選，選擇優勢性狀的個體或群體進行培養，能夠提高養殖的經濟效益，從而保護優秀的種質資源。近年來，越來越多的研究利用SSR作為分子標記對水產養殖物種進行了性狀關聯分析。袁文成等[36]采用高通量測序法，從翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）的轉錄組中篩選得到13對EST-SSR（Expression Sequence Target SSR）引物，對體長、體高、體厚及體重4種生長性狀進行標記性狀相關性研究，結果發現有5個微衛星標記與生長性狀顯著相關。該研究為翹嘴鱖的種質資源保護以及分子輔助標記育種提供分子機制上的依據。王丹等[37]通過對鰱（Hypophthalmichthys molitrix）的卵組織進行轉錄組測序分析，篩選出36個條多態性高的EST-SSR標記，其中兩個位點（SCE26和SCE65）與生長性狀顯著相關。在全同胞家系中的統計分析發現，SCE26與鰱的體長和體重顯著相關，而SCE65與鰱的肥滿度顯著相關。該研究為鰱的生長性狀相關的基因鑒定提供幫助，為分子標記輔助育種提供基礎的理論指導。由上述研究實例可以看出，SSR標記進行數量性狀定位已經在水產養殖中發揮了重要作用。伴隨著第二代測序技術的廣泛應用和價格的持續走低，SSR標記的開發越發簡單，以SSR為分子標記的生長性狀相關的研究將在水產養殖中發揮越來越重要的作用。

3.3 DNA指紋圖譜構建

Jefferys等[38]將人源小衛星DNA作為基因探針，與人體核DNA酶切片段雜交，得到由多個位點等位基因組成的長度不一的雜交帶圖紋，此圖紋類似指紋，極少有兩個人完全相同，所以稱作DNA指紋（DNA fingerprint），多個DNA指紋組成DNA指紋圖譜（DNA finger print）。DNA指紋圖譜有多位點性、高變異性、遺傳穩定的特點，可用于個體的鑒定、親子關系鑒定以及檢測目標基因組的變化。

鑒于DNA指紋圖譜的上述優點，研究者們已將此項技術廣泛應用于水產養殖中種質資源鑒定和物種區分，并取得了多項研究成果。廖梅杰等[39]采用指紋圖譜技術對中國青島、煙臺，韓國浦項、群山、木浦，俄羅斯符拉迪沃斯托克的刺參（Apostichopus japonicus）群體進行了指紋圖譜構建。其研究中篩選出的13個微衛星位點特異性較高，能夠把8個實驗群體一一區分開來，為以后刺參的種質資源鑒定提供了數據支撐。王成龍等[40]為了在草魚（Ctenopharyngodon idellus）雌核發育后代的群體中區分出雌核發育草魚以及團頭魴（Megalobrama amblycephala）和草魚的雜交后代，構建了由14個SSR標記組成的3個草魚群體的DNA指紋數據庫構建DNA指紋圖譜。此圖譜可以簡單、高效地區分出雌核發育的草魚個體和草魴雜交個體。我國是水產養殖大國，水產物種種群具有多樣性，DNA指紋圖譜的構建將會指導種群種質資源的鑒定和挖掘，進而促進水產養殖行業的發展。

3.4 遺傳連鎖圖譜構建

遺傳連鎖圖譜是指某一物種已知基因或遺傳標記在染色體上的相對位置。遺傳作圖（Genetic mapping）即遺傳圖譜的構建，是利用遺傳學原理和方法，構建能反映基因組中遺傳標記之間遺傳關系的圖譜。SSR分子標記因其上述特點成為構建遺傳連鎖圖譜的重要分子標記。因為遺傳連鎖圖譜的制作有利于水產動物功能基因和優良性狀的深入研究，眾多的研究利用SSR標記在多個水產物種中構建了遺傳連鎖圖譜，并在水產養殖中進行了廣泛的應用。

趙永偉等[41]以半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的全同胞家系為作圖群體，構建了其雌、雄的SSR標記遺傳連鎖圖譜。他們構建的連鎖圖的覆蓋率各為83.3%和82%，其質量已達中等水平，可一定程度上指導半滑舌鰨的遺傳育種工作。龐仁誼等[42]通過SSR標記對牙鲆（Paralichthysolivaceus）遺傳連鎖圖譜的構建，相比于宋文濤等[43]國內構建的牙鲆第一張遺傳連鎖圖譜有更高的覆蓋率，且標記數也有所增加，使得圖譜的質量、可信度和實際使用價值都得到了相應的提高，該圖譜進一步推動了牙鲆的遺傳育種工作。Guo等[44]利用SSR標記構建了鰱（Hypophthalmichehys molitrix）的第二代遺傳連鎖圖譜，該遺傳連鎖圖譜覆蓋率明顯提升，達到了93.1%，為鰱的數量性狀基因的定位、比較基因組學和標記輔助選擇等研究提供了遺傳學基礎。

4 結語

水產養殖業是我國重要的支柱產業，水產養殖業的健康、優質、可持續發展離不開現代科學技術的支持。分子標記輔助育種作為重要的科學育種手段，已經廣泛應用到水產養殖行業中。SSR標記技術因為其自身的優勢，能夠對養殖群體進行遺傳多樣性分析，為保護種質資源提供重要的指導;對數量性狀進行定位和分析，篩選出具有生長優勢的基因型，提高水產養殖的經濟效益;制作覆蓋率高的遺傳連鎖圖譜，為以后的育種和養殖提供遺傳學基礎;制作DNA指紋圖譜，能夠在混養的大型養殖環境中，避免近親交配所帶來的種質退化、生長個體變小、生長優勢消失等現象。隨著生物信息技術和分子生物學的不斷發展，SSR標記的開發和利用將會不斷深入，使其在水產養殖領域具有廣闊的應用前景。

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Abstract：In order to understand the application of simple sequence repeats （SSR） molecular markers in aquaculture and to develop marker-assisted breeding for aquaculture animals in the future， the research progress of the development methods of SSR， genetic diversity analysis in breed population， quantitative trait mapping， DNA fingerprinting and genetic linkage map construction by using SSR were reviewed. SSR molecular markers have broad application prospects in germplasm identification， genetic distance analysis and molecular marker-assisted breeding of aquaculture animals.

Key words：SSR; molecular markers; aquaculture

（收稿日期：2021-07-13）