益氣養陰活血法對自發性2型DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響

曾娜

【摘要】目的：分析益氣養陰活血法對自發性2型糖尿病心肌病變（Diabetic cardiomyopathy， DCM）大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法：選擇由本院自養新生純種大鼠60只。隨機分為模型組（對照組、觀察組）和正常組，使用鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）誘導建立模型，觀察組第4周齡使用益氣養陰活血復方治療，對照組無治療。對比不同大鼠一般情況，心肌細胞凋亡及增殖情況。結果：模型組大鼠均建模成功，血糖均≥16.67 mmol/L，在建模一周后出現多飲、多食、多尿現象，體重減輕，無活動，給藥觀察組上述情況均有所改善。對照組心肌對位結構，肌原纖維，線粒體均異常改變；觀察組心肌肌節、肌源纖維、線粒體基本正常。心臟重量指數、血糖從高到底依次為對照組>觀察組>正常組，體重為正常組>觀察組>對照組（P<0.05），對照組大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡細胞明顯高于正常組和觀察組，Bcl-2、Bcl-2/Bax值則低于其他組（P<0.05）；觀察組PCNA陽性細胞數明顯高于正常組與對照組，凋亡細胞情況高于對照組（P<0.05）。結論：益氣養陰活血法可降低自發性2型DCM大鼠心肌細胞凋亡情況，增強其細胞增殖活性，并改善心肌細胞結構。

【關鍵詞】益氣養陰活血法；自發性2型DCM大鼠；心肌細胞凋亡；影響

[中圖分類號]R285.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）05-0010-02

糖尿病心肌病變（Diabetic cardiomyopathy， DCM）則為糖尿病患者常見的并發癥之一[1]。最早在1983年時Tahini等人發現使用鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）誘導糖尿病大鼠后，其心肌功能在第6～14周出現改變，后在梁自文等實驗中也在證明糖尿病與心肌病變之間存在直接聯系[2-3]。糖尿病可引起心臟微血管病變出現心肌代謝紊亂，最終導致心肌廣泛局灶性壞死，在早期常可見患者心肌順應性下降舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全現象。本文使用STZ誘導建立DCM大鼠模型，旨在研究益氣養陰活血法對自發性2型DCM大鼠心肌細胞凋亡的影響，為臨床診治提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇由本院自養新生純種大鼠60只。隨機將其分為模型組（對照組和觀察組）。模型建立：對照組20只，觀察組20只，另設置正常組20只。對照組和觀察組在出生后24 h內使用腹腔注射由美國Sigma公司所提供的STZ（90 mg/kg），并在第6 d后再次注射STZ（45 mg/ kg）；正常組則注射相同劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。所有大鼠均在注射后6周檢測大鼠糖耐量、血清胰島素情況。大鼠空腹血糖有輕度升高，在糖耐量檢測中1 h血糖超過16.65 mmol/L、血清胰島素表現為相對不足則表示成功建模。觀察組大鼠則在大鼠第4周齡使用益氣養陰活血復方（組成藥物人參、麥冬、五味子、丹參、檀香等藥物），用水煎呈1 mL藥液含2 g生藥的200 %濃度藥液，每100 g體重給予0.8 mg，每天進行一次治療，對照組大鼠則不給予治療。在飼養到16周齡時處死。

1.2方法 ①大鼠一般情況觀察：在實驗期間需要觀察大鼠飲水、排尿、精神、活動等一般情況，在處死前禁食后12 h稱量大鼠體重以及空腹血糖情況。②大鼠心肌細胞情況觀察：將大鼠處死，采血后取出心臟，使用冰生理鹽水將包膜、血管清洗干凈，稱重大鼠心臟重量，與大鼠體重的比值為其心臟腫重量指數。隨后后取大鼠左心室前壁的心臟組織經處理后使用透射電鏡觀察。并組化染色檢測心肌細胞中死亡因子（FasL）、死亡因子受體（Fas）、Bax蛋白、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen， PCNA）蛋白表達情況。Fas、FasL、Bax、Bcl-2細胞漿內為棕黃色（或是棕褐色）的片狀表達，病理圖像分析使用MIPS系統分析。在高倍鏡（×400）下測定細胞陽性的平均灰度值；PCNA在細胞核中為棕褐色表達，隨機選擇5個視野進行計數并選取平均值。

心肌細胞凋亡原位標記檢測，在標本制片，使用水和多聚甲醛（4%）進行浸泡，實踐為15 min，再使用蛋白酶K進行消化，時間為12 min，隨后使用多聚甲醛（5 min）、平衡緩沖液10 min，標記液2 h使用3 %的過氧化氫浸泡4 min，最后鏈霉親和素浸泡，時間為20 min。使用顯微鏡觀察，在隨機5個高倍鏡視野下技術，陽性細胞的百分數并取其平均值。細胞凋亡：DAB著色細胞核表現為棕黃色則代表凋亡細胞。

1.3觀察指標 對比不同大鼠的一般情況（心臟重量指數、體重、血糖、心肌超微結構改變情況等）心肌細胞凋亡及增殖情況。

1.4統計學方法 采用SPSS25.0軟件包進行處理。計量資料以均數±標準差（_ x±s）表示，多組間比較使用方差檢驗，事后兩兩比較采用SNK-q；計數資料采用率或百分百進行描述，進行c2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1三組大鼠一般情況比較 正常組大鼠一般情況正常；模型組大鼠均建模成功，側血糖均≥16.67 mmol/L，均存活至16周，在建模一周后大鼠出現多飲、多食、多尿現象，體重減輕，活動能力下降，皮膚有破損或出血現象，給藥觀察組則上述情況均有所改善。

心肌超微結構觀察發現，正常組大鼠心肌情況基本正常；模型組：①對照組大鼠心肌結構改變，對位錯亂，出現有過度收縮，肌原纖維部分溶解，線粒體可見腫脹明顯，可嵴斷裂溶解和小空泡；②觀察組大鼠心肌肌節對有少部分出現錯位，其他情況基本正常。

心臟重量指數、血糖從高到底依次為對照組>觀察組>正常組，體重從高到底依次為正常組>觀察組>對照組，三組之間比較差異存在統計學意義（P<0.05），詳見表1。

2.2模型組大鼠心肌細胞凋亡與增殖情況比較 對照組大鼠Fas、FasL、Bax、凋亡細胞明顯高于正常組和觀察組，Bcl-2、Bcl-2/Bax值則低于正常組和觀察組（P<0.05）；觀察組PCNA陽性細胞數明顯高于正常組與對照組，凋亡細胞情況明顯低于對照組（P<0.05），詳見表2。

3 討論

DCM發病機制較為復雜，中醫治療藥物以整體性、辯證論治為特色，對于糖尿病以及其并發癥防治中有著較為明顯的優勢。DCM在中醫中屬于“心悸”、“消竭”、“胸痹”、“心痛”、“胸痛”等范疇，血瘀、氣虛為其主要病機。以往有文獻研究證明使用益氣養陰活血法對于DCM治療有較好的臨床使用效果，可通過多通路、多靶點減輕心肌纖維化情況，從而達到延緩高血糖大鼠出現DCM[4]。在本文研究中使用益氣養陰活血法方劑中包括人參、麥冬、五味子、丹參、檀香等藥物中，人參藥理研究中發現，其可調節血脂、控制血壓、減輕患者體重改善患者凝血功能從而達到調整糖尿病患者機體代謝紊亂裝狀況。藥單體有抑制TGF-β1分泌，減少心肌細胞凋亡延緩心肌細胞纖維化作用。麥冬中皂苷、多糖、黃酮等有效成分，可起到降血糖、抗氧化等作用從而產生對心肌的保護。五味子藥理學研究證明可降血糖、血壓同時增強機體免疫力。丹參則有活血調經、祛瘀止痛、養血安神等過作用，檀香具有消腫、止血、定痛的作用研究表明，檀香與丹參相配可增加丹參的吸收入血，使其作用持久。

在本文研究中發現在16周后DCM大鼠模有典型的糖尿病心肌病變，大鼠心肌細胞凋亡情況也明顯高于其他兩組，與以往文獻研究結果相符[5]。而在使用益氣養陰活血復方治療的觀察組大鼠中，心肌肌節對位基本正常，有少部分出現錯位，肌源纖維、線粒體基本正常。心臟重量指數、血糖從低于對照組，體重從高于對照組（P<0.05），與以往文獻研究結果相符[6]，提示使用益氣養陰活血復方可改善CDM大鼠體重、血糖、心肌細胞情況。以往文獻研究中均表明，Fas、FasL和 Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax比值是細胞凋亡的重要影響因素[7]。在本研究結果中發現，使用益氣養陰活血復方治療后，降低了心肌細胞中促凋亡因子Fas、FasL和 Bax表達，Bcl-2/Bax比值則增加，且凋亡細胞明顯減少，提示益氣養陰活血復方可減少氧自由基生成，保護了抗氧自由基酶系統活性，起到調控凋亡因子的變化減少心肌細胞凋亡。PCNA直接參與了DNA復制，是細胞增殖活性的重要指標。在本研究中對照組與正常組PCNA陽性數比較并無明顯差異可能與本研究大鼠未出現心肌細胞異常增殖有關。而觀察組大鼠心肌PCNA陽性比例明顯高于其他兩組提示此藥方可有啟動心肌細胞的增殖作用，達到防治DCM的目的。

綜上所述，益氣養陰活血法可降低自發性2型DCM大鼠心肌細胞凋亡情況，增強其細胞增殖活性，并改善心肌細胞結構。

參考文獻

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