CTAB調控乳腺癌干細胞抑制遷移

李 寧，潘 悅，陶 旭 鋒，肖 桂 山

(大連理工大學 化工學院,遼寧 大連 116024)

0 引 言

有研究表明約90%的癌癥相關死亡是由腫瘤轉移引起的[1]．乳腺癌可以轉移到骨、肺和腦等部位，目前大多數與乳腺癌相關的死亡歸因于轉移而不是原發性腫瘤的生長[2-4]．乳腺癌目前的治療方法有手術、化學療法、中藥和免疫治療等[5-6]．盡管最近在醫學上取得了重大進步，但是這些治療方法對乳腺癌的轉移有一定的局限性，因此乳腺癌轉移仍然是目前乳腺癌臨床治療需要面對的重要困難．

腫瘤轉移是一個復雜的過程，并不是所有的腫瘤細胞都能夠在這個過程中存活并且通過血管滲透和遷移到達新的部位，只有具有攻擊性的癌細胞才能完成腫瘤細胞的轉移并定植生存．類腫瘤干細胞(cancer stemness cells，CSCs)被認為存在于大多數原發性腫瘤中并帶有自我更新和分化特性，具有較強的攻擊性，可以從中衍生出轉移性細胞向遠處轉移[7]．因此有研究表明癌癥復發以及轉移的根本原因是CSCs的存在，并且通過調控CSCs可以影響乳腺癌的轉移[8]．在Wang等的研究中，Anillin通過涉及細胞干性和分化控制的非經典機制來調節乳腺癌細胞的遷移、生長和轉移[9]．喬書培研究發現miR-486-3p可以調控MAPK信號通路進而阻礙乳腺癌干細胞的增殖來抑制乳腺癌的轉移[10]．因此，研究乳腺癌干細胞對乳腺癌轉移具有重要意義．

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)是一種季銨鹽并具有兩性結構，即具有非極性疏水尾巴和帶正電荷的極性頭部．這種結構可以幫助CTAB附著在細胞膜上并形成納米級微孔．因此，CTAB可以破壞脂質雙層并增加細胞膜的通透性從而誘導細胞凋亡．有很多研究表明CTAB對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，因此CTAB有可能成為抗腫瘤的候選藥物．而以前的工作表明，CTAB可以通過靶向多種信號通路，誘導肝癌細胞凋亡以及逆轉乳腺癌的耐藥性[11-12]，但是CTAB是否可以調控乳腺癌的轉移目前尚不清楚．本實驗擬在探討CTAB對乳腺癌轉移的治療作用并初步闡述其調控乳腺癌轉移的相關機制．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CTAB(H6269-250G，純度≥99%)購自Sigma Aldrich公司，DMEM高糖培養基(C11995500BT)購自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自PAN公司．MTT(M8181-1G)、青霉素、鏈霉素、BCA蛋白測定試劑盒(PC0020)和總蛋白提取試劑盒(R0020)購自Solarbio公司．Super ECL Plus超靈敏發光液(P1050，100 mL)購自Solarbio公司．一抗β-actin(66009-1-lg)購自Proteintech公司，CD44(3570)和CD133(64326S)抗體購自Cell Signaling Technology公司，APC Mouse Anti-Human CD44(560890)和PE Mouse Anti-Human CD133(566593)抗體購自BD Biosciences公司，兔二抗(A25022)和鼠二抗(A250012)購自美國Abbkine公司．雙丙烯酰胺(M104026-100g)購自Aladdin公司，四甲基乙二胺(TEMED)購自Macklin公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及MTT檢測 將ZR-75-1細胞(購自南京科佰生物科技有限公司)培養在DMEM高糖培養基中，培養基中添加10% FBS、100 units/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，在5% CO2的細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)里于37 ℃進行培養．在96孔板中進行MTT測定以評估細胞活力．將ZR-75-1細胞用胰蛋白酶消化，用含FBS的培養基終止消化，離心棄上清液，用FBS清洗ZR-75-1細胞一次，加入新的培養基，將細胞以5×103個/孔的密度接種到每個孔中以進行過夜培養，然后加入終濃度為0、0.247、0.521、1.04、2.06、4.12、8.23、16.5、33.0 μmol/L的CTAB處理ZR-75-1細胞24 h．隨后，將20 μL MTT溶液(5 mg/mL)添加到每個孔培養4 h．最后，將甲臜藍紫色晶體用150 μL DMSO溶解并用酶標儀(Tecan，Infinite 200 Pro)以490 nm 波長測量吸光度．

1.2.2 細胞劃痕實驗 將細胞接種到6孔板中，待其生長至80%～90%密度，用200 μL黃色移液管尖端將細胞單層去除，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次以除去細胞碎片．然后將細胞在具有CTAB(ZR-75-1細胞1.04 μmol/L)的DMEM中孵育24 h．最后，使用倒置顯微鏡(Olympus 公司，U-RFL-T)觀察細胞遷移并測定其距離．在每個孔中分析5個隨機選擇的區域，通過計算劃痕寬度變化的百分比來量化細胞遷移能力．

1.2.3 Transwell細胞遷移分析 為了檢測CTAB對乳腺癌腫瘤轉移的影響，使用孔徑為8 μm 的Transwell小室(Corning Costar公司)進行遷移分析．將細胞用胰蛋白酶消化，并以5×104個/mL的密度懸浮在不含有FBS的DMEM中．隨后，將細胞懸浮液和含有10% FBS的培養基分別裝入上隔室和下隔室．待細胞貼附后，將實驗分為CON組(加入FBS)和CTAB組(加入終濃度為1.04 μmol/L的CTAB)，在37 ℃的5% CO2中溫育24 h后，用棉簽擦拭上表面的細胞，將下表面上遷移的細胞固定并染色．用4%多聚甲醛固定細胞30 min，并用0.1%結晶紫溶液染色20 min．用33%乙酸洗滌聚碳酸酯膜后，在600 nm 波長下測量吸光度并計算遷移率．

1.2.4 流式細胞儀檢測腫瘤干性 CON組和CTAB組取5×105個ZR-75-1細胞，用PBS洗滌2次，21 ℃、2 100 r/min下離心4 min，棄去上清液，加入200 μL染色緩沖液吹勻細胞．向CON組和CTAB組懸浮液中均加入20 μL CD44抗體和5 μL CD133抗體，4 ℃放置30 min．將染色的ZR-75-1細胞用染色緩沖液洗滌2次，然后再加入500 μL染色緩沖液吹勻，使用Life Attune聲波聚焦流式細胞儀(Thermo Fisher Scientific，Attune NxT)選擇對應的熒光通道進行檢測．

1.2.5 免疫熒光技術 以2×104個/孔的密度將ZR-75-1細胞培養在24孔板中，第2 d給予1.04 μmol/L CTAB，長至80%左右用PBS清洗，使用4%的多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗滌2次；3%的H2O2孵育15 min，PBS洗滌2次；加入血清封閉，室溫封閉15 min，棄去血清；一抗4 ℃過夜，次日回收一抗，PBS洗滌2次；熒光二抗孵育1 h，棄去二抗，PBS洗滌2次；加入DAPI染料1 min，棄去，PBS洗滌2次，倒置熒光顯微鏡拍照．

1.2.6 Western Blot檢測相關蛋白表達 將CON組和加入1.04 μmol/L CTAB處理的細胞，消化洗凈后，加入RIPA裂解液和PMSF混合液(按體積比100∶1混合)，按Solarbio總蛋白提取試劑盒提取總蛋白．使用Solarbio試劑盒(BCA法)檢測蛋白濃度，按比例加入5倍的上樣緩沖液后95 ℃孵育10 min．每條泳道加入10～20 μg蛋白樣品，設置恒壓80 V跑至分離膠，然后調至恒壓130 V跑至結束．將膠轉移至甲醇活化的PVDF膜上，300 mA恒流轉膜60～120 min，牛奶封閉3 h，用TBST洗膜，一抗(體積比1∶1 000 稀釋)4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，室溫孵育二抗2 h，TBST清洗，ECL超敏顯影液孵育PVDF膜，凝膠成像儀(Bio-Rad，17001402，ChemiDoc MP Imaging System)顯影．

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0進行數據處理和統計分析，結果以平均值±標準差表示，使用t檢驗(兩組)或是雙邊ANOVA(多組)評估組間統計差異，P<0.05被認為具有統計學意義．

2 結 果

2.1 篩選CTAB用于乳腺癌轉移治療的安全濃度

選取乳腺癌ZR-75-1細胞，給予CTAB的濃度為0、0.247、0.521、1.04、2.06、4.12、8.23、16.5、33.0 μmol/L，分別處理ZR-75-1細胞24 h和48 h，采用MTT法測定CTAB對ZR-75-1乳腺癌細胞存活率的影響．篩選CTAB不引起乳腺癌細胞死亡的最大濃度，結果顯示24 h后，CTAB對ZR-75-1細胞不引起殺傷的最大濃度為1.04 μmol/L(如圖1所示)．因此在24 h之內選擇1.04 μmol/L作為后續治療濃度，而在48 h內選擇0.521 μmol/L作為后續治療濃度．

(a)ZR-75-1-24 h

2.2 CTAB抑制乳腺癌ZR-75-1細胞的轉移

本實驗選擇乳腺癌ZR-75-1細胞，以檢測CTAB對乳腺癌轉移的影響．首先使用傷口愈合測定法測量癌細胞遷移能力．將ZR-75-1培養在96孔板中，待細胞貼壁長至80%，用200 μL槍頭在6孔板內平行劃3條線，PBS洗去多余細胞，給予1.04 μmol/L的CTAB處理24 h．結果顯示，孵育24 h后，CON組中的ZR-75-1細胞迅速擴散到傷口區域，傷口接近完全愈合，而CTAB處理的細胞向傷口區域的擴散速度比CON組慢(圖2(a))．這些結果證明CTAB具有抑制乳腺癌細胞遷移的能力．

使用經典的Transwell實驗進一步驗證CTAB對ZR-75-1細胞遷移的影響．將細胞洗凈離心后加入無血清培養基，小室內加入400 μL 共5×103個細胞，下室內加入600 μL培養基(包含10%的胎牛血清)，3～4 h后給予1.04 μmol/L 濃度的CTAB，放入細胞培養箱培養24 h，固定染色拍照．Transwell遷移分析的結果表明，CON組被染色的細胞的數量明顯多于CTAB組細胞的數量，CTAB可以減少ZR-75-1細胞通過聚酯纖維膜的細胞數量(圖2(b))．統計分析，CTAB組的相對細胞遷移率顯著低于CON組(圖2(b))．這部分結果表明CTAB可以抑制乳腺癌細胞的遷移能力．

2.3 CTAB抑制乳腺癌細胞系干細胞

為了探究CTAB抑制乳腺癌ZR-75-1細胞轉移的作用機制，使用流式細胞術檢測CTAB對乳腺癌干細胞比例的影響．CD44和CD133是乳腺癌干細胞的特定表面標志物．CD44+/CD133+雙陽性已被廣泛應用于鑒定乳腺癌干細胞[13-15]．選取乳腺癌細胞ZR-75-1，給予1.04 μmol/L CTAB處理24 h，使用CD44和CD133抗體共染乳腺癌細胞．實驗發現，CON組細胞在CD44+/CD133+雙陽性區域(Q2)的比例為10%，加入CTAB處理24 h后，細胞在CD44+/CD133+雙陽性區域(Q6)的比例為1.4%，相較于CON組，雙陽性的細胞比例明顯下降(圖3(a))．

同時CD44和CD133抗體共染乳腺癌細胞，免疫熒光結果顯示，CTAB處理后，綠色熒光和紅色熒光明顯變淺，CD44+和CD133+在細胞中的表達明顯減少(圖3(b))．上述結果證實，CTAB可降低乳腺癌干細胞(CD44+/CD133+)比例．

為了進一步探究CTAB對調控乳腺癌ZR-75-1細胞干性的作用，本研究進一步驗證CTAB對乳腺癌細胞成球能力的影響．將ZR-75-1細胞消化離心，PBS洗凈細胞，加入干細胞培養基重懸細胞，使用超低吸附24孔板，1×103個/孔，CTAB組給予1.04 μmol/L的CTAB，每天拍照觀察，于第8 d結束實驗．結果如圖4(a)所示，CTAB組的乳腺癌ZR-75-1細胞成球數量變少且體積變小，證明CTAB可以抑制乳腺癌細胞的成球能力．

(a)ZR-75-1劃痕實驗

(b)免疫熒光觀測干細胞比例

為了研究CTAB對乳腺癌干細胞干性的抑制作用，檢測了乳腺癌干性標志物CD44和CD133的mRNA和蛋白水平．CTAB處理ZR-75-1細胞24 h后，qRT-PCR結果顯示CTAB在mRNA水平下調CD44和CD133(圖4(b))．與mRNA水平一致，Western Blot結果顯示CTAB降低了CD44和CD133的蛋白表達(圖4(c))．

(a)CTAB抑制乳腺癌ZR-75-1細胞成球

這些結果表明，CTAB可以抑制乳腺癌ZR-75-1干細胞的數量以及細胞干性．

3 討 論

越來越多的證據表明，乳腺癌干細胞(BCSCs)與乳腺癌疾病的惡性程度密切相關，且BCSCs在乳腺癌進展中起著重要的作用．BCSCs位于腫瘤細胞的起始位置，具有自我更新的能力，可以分化為多種癌細胞[16]．已有多項研究表明調控乳腺癌干細胞對乳腺癌轉移具有作用．Reithmeier 等發現TRAP通過TGFβ2/TβR和CD44促進MDA-MB-231乳腺癌細胞的轉移[17]．Li等證實miR-520a-3p抑制CCND1和CD44表達從而抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[18]．韓亞娟等的實驗表明CD133促進乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲和轉移[19]，因此乳腺癌干細胞可作為治療乳腺癌轉移的關鍵靶點．本文的結果表明，在流式細胞術和免疫熒光實驗中CTAB可以降低乳腺癌ZR-75-1細胞中CD44+/CD133+雙陽性干細胞的比例，并且可以抑制ZR-75-1細胞的成球能力．在mRNA和蛋白水平，CTAB均一致降低了CD44和CD133的表達．因此，CTAB可以調控乳腺癌干細胞來抑制乳腺癌ZR-75-1細胞的遷移．因此，CTAB可作為乳腺癌轉移治療的潛在化合物，且是通過調控乳腺癌干細胞實現的．

在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞會面臨巨大的挑戰，包括在系統循環中的失常和剪切應力誘發的細胞凋亡，在遠處器官定植時的高氧化應激，以及暴露于新的惡劣環境中的代謝應激[20]．當前研究已表明代謝重編程賦予轉移性癌細胞適應代謝應激和氧化應激等不利環境的能力．AMPK是AMP激活的蛋白激酶，由3個亞基組成的異源三聚體復合物：帶有蛋白激酶催化結構域的α亞基(由蛋白激酶AMP激活的α(PRKAA)編碼)和非催化性β(PRKAB)、γ(PRKAG)調節亞基，是哺乳動物組織中細胞代謝和能量穩態的主要調節器[21-22]．關于AMPK和癌癥轉移的關聯已有較多研究．脂聯素治療增加LKB1的表達，提高AMPK活性，從而抑制乳腺癌細胞的黏附，遷移和侵襲能力被抑制[23]．Cai等的研究結果顯示在小鼠轉移模型中激活的AMPK驅動丙酮酸脫氫酶復合物(PDHc)活化以維持三羧酸循環(TCA循環)并通過使癌細胞適應代謝和氧化應激來促進癌癥轉移[20]．另一方面，課題組之前的研究也說明了CTAB可通過激活AMPK在體外和體內增強乳腺癌對阿霉素(DOX)的藥物敏感性[12]．那么CTAB是否通過調控AMPK來影響乳腺癌細胞干性進而影響腫瘤轉移值得進一步探討．

本研究的實驗結果初步證明CTAB具有良好的抑制乳腺癌細胞轉移作用．CTAB作為納米材料的打孔劑被認為應該完全去除，本研究提示了一定濃度的CTAB對乳腺癌細胞有殺傷作用，并且課題組先前的研究證實CTAB可以提高乳腺癌細胞對DOX的敏感性以及CTAB促進乳腺癌細胞凋亡，因此本文為CTAB能夠應用于未來乳腺癌的治療及其成藥潛力提供了一定的理論依據．本研究還存在一些局限性，下一步將使用更多的乳腺癌細胞系來確定CTAB對乳腺癌干性以及轉移的調控作用．進一步的研究將使用小鼠乳腺癌轉移模型，集中說明CTAB在體內對乳腺癌轉移的作用以及CTAB對體內癌細胞干性的調控作用．

4 結 語

長碳鏈季銨鹽類化合物CTAB可以抑制乳腺癌CD44+/CD133+雙陽性干細胞比例和干性標記物CD44和CD133的表達．本實驗證實CTAB具有抑制乳腺癌干性進而調控乳腺癌轉移的潛力．CTAB給藥或許是乳腺癌轉移治療的新策略．