高分子量麥谷蛋白亞基組成及其與小麥品質性狀的關系分析

范家霖，陳曉杰，張建偉，程仲杰，王嘉歡，張福彥，楊保安

(河南省科學院同位素研究所有限責任公司/河南省核農學重點實驗室，河南鄭州 450015)

小麥是我國主要糧食作物之一，適合制作饅頭、面條、面包、糕點、餅干等多種食品，以滿足消費者的不同需求[1]。隨著我國經濟的快速發展、人民物質生活水平的逐漸提高以及居民膳食結構的改變，消費者對小麥品質的要求越來越高。我國小麥生產不斷進行結構性調整和供給側改革，逐漸從單純產量型向優質、高產、高效型轉變，品質改良已成為我國小麥育種的重要目標之一[2]。長期以來，我國小麥蛋白質含量并不低，但蛋白質和面筋的質量較差，面筋強度和延展性有待進一步提高，小麥品質較國外品種偏差[3]。醇溶蛋白和麥谷蛋白的不同構成比例和特性對小麥面筋質量、面團粘彈性等加工特性具有決定作用[4]。小麥醇溶蛋白分為α、β、γ、ω四種類型，主要影響面團的延展性；麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白(HMW)和低分子量麥谷蛋白(LMW)，分別占胚乳總蛋白含量的10%和40%左右[5]。盡管HMW在小麥籽粒中的含量較低，但HMW仍是目前公認的影響小麥面粉品質的關鍵因素，影響約60%的面包烘烤品質性狀變異[6-7]。

Payne和Corfield[8]利用SDS-PAGE的方法鑒定分析了小麥高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)的組成，并發現Glu-A1位點上的x1亞基影響小麥面粉的烘烤品質。此后，國內外學者對HMW-GS的組成及其與小麥品質的關系開展了大量的研究。HMW-GS由小麥第一同源染色體上3個復合位點上的編碼基因控制，被命名為Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，分別位于1A、1B、1D染色體長臂上[9]。不同HMW-GS編碼基因保守區序列高度一致，而重復序列上SNP位點差異或DNA片段的插入、缺失致使HMW-GS形成不同的類型[10-11]。不同HMW-GS類型對小麥品質效應不同，不同的亞基和亞基組合類型對小麥品質的貢獻也不盡相同。國內外學者研究表明，小麥優質亞基主要有Glu-A1位點上的x1和x2*亞基，Glu-B1位點上的x7+y8、x7OE+y8、x14+y15、x13+y16和x17+y18亞基，Glu-D1位點上的x5+y10亞基，而Glu-B1位點上的x20亞基和Glu-D1位點上的x2+y12亞基則對小麥加工品質具有負效應[12-14]。我國小麥品種的HMW-GS組成非常豐富，但優質亞基出現的頻率偏低，且不同生態區域內小麥HMW-GS組成及其對小麥品質的效應也存在一定差異。我國北方麥區部分小麥品種的HMW-GS組成對蛋白質含量和沉降值的效應不同，在北方麥區品種中沒有發現具有明顯優勢的亞基組合類型，優質亞基 1Ax2*、1Bx17+1By18和1Bx14+1By15出現的頻率較低[14]。我國黃淮南片小麥品種中Glu-A1位點上的x1亞基、Glu-B1位點上x7+y8和x17+y18亞基、Glu-D1位點上的x5+y10亞基對蛋白質含量、濕面筋含量、沉淀值、形成時間、穩定時間等品質性狀都具有較大的正向效應[15]。河北、山西等小麥品種(系)中以1Ax1、1Bx14+1By15、 1Dx2+1Dy12亞基為主；Glu-B1位點上的4種亞基在各個品質指標間均存在顯著差異，其中x7+y8亞基對蛋白質含量和濕面筋含量的貢獻最高， x17+y18亞基對沉淀值和最大抗延阻力的貢獻最高，而攜帶x7+y9亞基的面團則具有最長的穩定時間[16-17]。HMW-GS豐富的遺傳多樣性可為我國小麥品質育種的優質亞基聚合提供有利條件。育種家通過有目的改良小麥HMW-GS優質亞基的組成，進而提高蛋白質質量、面筋強度等品質性狀，提升我國小麥品質，增強我國小麥品種的國際競爭力。截止目前，盡管已有關于小麥HMW-GS組成與蛋白質含量、濕面筋含量、沉淀值等品質性狀關系研究的相關報道，但有關HMW-GS組成對吸水率、最大抗延阻力以及拉伸面積等面團流變學特性影響的研究尚無報道。本研究擬通過對127份小麥種質資源的HMW-GS組成和吸水率、最大抗延阻力、拉伸面積、穩定時間等主要品質性狀進行檢測，分析HMW-GS單個亞基及其組合與小麥品質性狀的關系，旨在明確優質亞基的主要品質功能，為我國小麥品質的遺傳改良提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料04中36、豫豐11、濟麥44、鄭品麥22號、鄭品麥24號、漯6073、豫同113、西農979、鄭品優18、小偃81、周麥27、周麥36、鄭品優9號等127份小麥品種(系)來自河南省科學院同位素研究所小麥育種室收集的種質資源圃，這些材料主要涵蓋了黃淮海麥區近20年來生產種植的小麥品種(系)。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗

2018—2019年度在河南省科學院新鄭試驗基地種植，每個品種(系)種植2行，行長2.5 m，行距0.25 m，每行播50粒種子，待出苗后每行定苗至30株左右。田間管理同大田生產，正常成熟后人工收獲、脫粒，及時晾曬后貯藏備用。

1.2.2 品質性狀檢測

將收獲后的小麥品種(系)種子在同一儲藏條件下放置2個月，水分控制在11%～13%之間。利用DA7200型近紅外谷物分析儀測定籽粒蛋白質含量、濕面筋含量和沉降值；利用Perten 4100型單粒谷物特性測定儀測定小麥的籽粒硬度、水分含量等。依據硬度和水分含量進行潤麥，其中硬質麥潤麥至水分含量為16.5%，混合麥為 15.5%，軟質麥為14.5%，用Chopin CD1型實驗磨粉機進行磨粉，出粉率65%左右。利用Farinograph-E電子型粉質儀測定面粉吸水率、面團穩定時間、形成時間等品質性狀；利用拉伸儀測定最大抗延阻力、延伸性、拉伸面積等品質性狀。

1.2.3 小麥籽粒蛋白提取

參照紀 軍等[18]方法(稍有改動)進行小麥麥谷蛋白的提取和制備。選取1粒大小均勻一致的小麥種子充分研磨后放入2.0 mL離心管中，加入500 μL提取液A(7.5%異丙醇+0.3 mol·L-1NaI)制成懸浮液，65 ℃水浴30 min，期間震蕩2～3次，使懸浮液充分混勻；12 000 r·min-1離心3 min，棄上清液后，再重復提取一次。向沉淀中加入200 μL提取液B[25%異丙醇+0.04 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)+10%SDS+2%二硫蘇糖醇(DTT)]，65 ℃水浴30 min，期間震蕩幾次，充分混勻，再加入200 μL提取液C[25%異丙醇+0.04 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)+10%SDS+1.4%4-乙烯吡啶(4-VP)]后65 ℃水浴30 min，期間震蕩2～3次，使懸浮液充分混勻，12 000 r·min-1離心5 min，吸取200 μL上清液，轉移到另一個干凈的1.5 mL離心管中，加入200 μL樣品緩沖液[0.625 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)+20%甘油+ 0.5%溴酚藍+5%β-巰基乙醇]，輕微震蕩使其充分混勻，靜置30 min后，99 ℃加熱變性5 min，所得樣品即為麥谷蛋白溶液，自然冷卻后將制備的蛋白樣品直接進行電泳分析或-20 ℃保存備用。

1.2.4 SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳參照紀 軍等[18]和Khalid等[19]的方法進行。制備濃度為13%聚丙烯酰胺分離膠[0.375 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)、0.1%SDS]和5%聚丙烯酰胺濃縮膠[0.125 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)、0.1%SDS]，將 1.2.3中制備的麥谷蛋白樣品取5 μL點樣，用 0.025 mol·L-1Tris、0.1%SDS和0.19 mol·L-1甘氨酸配制的電極緩沖液進行電泳，12 mA穩流電泳10 h，待溴酚藍條帶離開凝膠30 min后結束電泳。小心剝離凝膠,在12%的三氯乙酸溶液浸泡中10 min, 用蒸餾水沖洗干凈后進行染色和脫色，直至背景淺淡、帶型清晰，將凝膠掃描成像并保存。

按照Payne等[20-21]提出的“字母-數字”命名標準確定參試材料的HMW-GS亞基類型，用已知HMW-GS帶型的鄭麥366(1Ax1、1Bx7+1By8、1Dx5+1Dy10)、小偃22(1Ax-null、1Bx7+1By9、1Dx2+1Dy12)和小偃81(1Ax1、1Bx14+1By15、1Dx2+1Dy12)為對照。

1.3 統計分析

利用Microsoft Excel 2013進行數據統計和表格繪制，采用SPSS 18.0進行方差分析(ANOVA)和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 HMW-GS組成及頻率

部分參試小麥品種(系)HMW-GS的SDS-PAGE電泳鑒定結果見圖1。127份小麥品種(系)中，共鑒定出1Ax1、1Ax-null、1Bx7+1By8、1Bx7+1By9、1Bx14+1By15、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10和1Dx2+1Dy12共8種亞基類型。在Glu-A1位點上，x1亞基類型出現的頻率最高，占70.1%，x-null亞基類型出現頻率為 29.9%；在Glu-B1位點上，x7+y8、x7+y9、x14+y15和x17+y18出現的頻率分別為34.7%、 42.5%、19.7%和3.1%；在Glu-D1位點上，x5+y10和x2+y12亞基類型出現頻率為51.2%和 48.8%。

1：中麥578；2：鄭品麥8號；3：豫豐11；4：鄭品麥24號；5：鄭品優18；6：鄭麥366(CK1)；7：豫農202；8：鄭品優9號；9：豐德存麥5號；10：鄭麥9023；11：商麥156；12：藁城8901；13：小偃81(CK2)

127份供試材料中，共鑒定出14種HMW-GS組合類型，其分布頻率見表1。1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12組合類型出現的頻率較高，分別占參試材料的18.9%和17.3%，其次為1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10和1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12組合類型，分別占12.6%和 11.0%。其余組合類型出現的頻率較低，其中1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10組合類型僅有2份材料，占1.6%；1Ax1/1Bx17+1By18/1Dx2+1Dy12組合類型僅有1份材料，占0.8%。

表1 供試材料HMW-GS組合類型及其分布頻率Table 1 HMW-GS combinations and the frequency of the 127 wheat varieties(lines)

2.2 小麥品質性狀分析

由表2可知，測定的所有品質性狀中，蛋白質含量和吸水率的變異系數較小，蛋白質含量變化范圍為11.30%～17.50%，吸水率變化范圍為50.80%～66.50%，其變異系數分別為6.90%和5.68%，而穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積的變異較大，其中，穩定時間變化范圍為1.10 min～25.40 min，其變異系數高達79.96%，最大抗延阻力和拉伸面積的變異系數分別為59.74%和59.28%。總體來看，參試材料中黃淮麥區品種(系)的沉降值、穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積的變化范圍較大，變異系數較高，遺傳多樣性 豐富，具有較大的遺傳改良潛力，為直接篩選出綜合品質性狀較優的小麥種質資源創造了有利 條件。

表2 127份小麥品種(系)的品質性狀Table 2 Quality performance of 127 wheat varieties(lines)

2.3 HMW-GS亞基分布及其對小麥品質的影響

在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點共檢測到8種HMW-GS亞基，且不同位點上的不同亞基對蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、吸水率、穩定時間等小麥品質性狀影響不同。結果(表3)顯示，在Glu-A1位點上，攜帶x1亞基材料的蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積顯著高于攜帶x-null的小麥品種(系)。在Glu-B1位點上，4種亞基對小麥品質指標的影響也不盡相同，其中攜帶x7+y8亞基品種(系)的沉降值、吸水率、穩定時間、最大抗延阻力、拉伸面積均顯著高于攜帶其他3種亞基類型的材料，而攜帶x17+y18亞基材料的蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、穩定時間均顯著高于攜帶x14+y15亞基和x7+y9亞基的材料，而攜帶x7+y9亞基品種(系)的除吸水率外其他品質指標顯著低于攜帶其他3種亞基類型的材料，x14+y15亞基對除蛋白質含量和濕面筋含量以外的其他品質性狀有負向效應；Glu-D1位點上，攜帶x5+y10亞基材料的蛋白質含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積均高于攜帶x2+y12亞基的材料，差異達到顯著水平，濕面筋含量顯著低于攜帶x2+y12亞基的材料，而二者的吸水率差異不 顯著。

表3 不同HMW-GS亞基對小麥品質的影響Table 3 Effect of different HMW-GS subunits on wheat quality

2.4 不同HMW-GS組合與品質效應的關系

127份供試材料中共發現14種HMW-GS組合類型，分析樣本數量大于3的12種不同組合類型與品質效應的關系，結果(表4)表明，攜帶不同HMW-GS組合類型品種(系)的蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、吸水率、穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積等品質性狀存在不同程度差異。攜帶1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品種(系)的蛋白質含量、沉降值、吸水率、穩定時間、最大抗延阻力、拉伸面積等品質性狀明顯較高，而攜帶1Ax1/1Bx17+1By18/1Dx5+1Dy10、1Ax1/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10、1Ax-null/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx2+1Dy12品種(系)的蛋白質含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力、拉伸面積等品質性狀也較高。攜帶1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10和1Ax1/1Bx14+1By15/1Dx2+1Dy12材料的品質性狀表現一般，而攜帶1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10的品種(系)在蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力、拉伸面積等品質性狀均明顯較低。

表4 不同HMW-GS組合類型與小麥品質效應的關系Table 4 Relationship between different HMW-GS combination types and quality effect of wheat

3 討 論

我國小麥品種的HMW-GS組成豐富，不同生態區域內不同來源小麥種質的HMW-GS組成和分布存在一定的差異。謝科軍等[15]研究發現，黃淮南片小麥品種中1Ax1(73.5%)、1Bx7+1By8(24.3%)和1Dx5+1Dy10(48.0%)優質亞基的比例較高，而含有1Ax2*(0.6%)、1Bx14+1By15(11.9%)、1Bx13+1By16(0.6%)、1Bx17+1By18(3.4%)、和1Dx5+1Dy12(1.1%)等稀有優質亞基的比例偏少。Gao等[16]發現，河北小麥品種攜帶1Ax1(43.0%)、1Bx7+1By8 (64.9%)、1Dx2+1Dy12亞基(74.8%)的比例較高，攜帶優質亞基1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By8、1Bx14+1By15、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10和1Dx5+1Dy12的比例呈逐漸上升趨勢。王 倩等[17]研究發現，山西水地小麥品系中攜帶1Ax1亞基的品系所占比例高達83.7%，而Glu-B1位點存在4種亞基類型，以x14+y15亞基(42.9%)為主，Glu-D1位點存在x2+y12 (71.4%)和x5+y10(28.6%)兩種亞基類型。權 威等[22]對國外小麥種質資源的HMW-GS組成進行分析，在Glu-A1位點發現x-null、x1和x2*三種亞基，其中優質亞基x2*(31.8%)所占的比例較高；Glu-B1位點上發現x7+y9、x17+y18、x7、x13+y16、x7*+y16*等14種亞基類型；Glu-D1位點發現x5+y10、x2+y12、x-null、x5+y12等5種亞基類型。本研究在供試材料Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點共發現8種亞基類型，其中優質亞基1Ax1(70.1%)、1Bx7+1By8 (34.7%)、1Bx14+1By15(19.7%)和1Dx5+1Dy10(51.2%)所占比例較高，而1Bx17+1By18 (3.1%)亞基出現的頻率較低，沒有發現1Ax2*和1Dx5+1Dy12類型的優質亞基。由此可見，我國小麥優質亞基利用仍較為單一，主要以1Ax1、1Bx7+1By8和1Dx5+1Dy10為主，而1Ax2*、1Bx7OE+1By8、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy12等其他優質亞基甚少。因此，在今后的強筋優質小麥品種培育中應加大對攜帶國外優質稀有亞基材料的利用。

HMW-GS與小麥主要品質性狀的關系極為密切。國內外學者對不同HMW-GS亞基以及組合類型與小麥品質的關系等方面已做較多研究。Horvat等[23]研究發現，1Ax1和1Dx5+1Dy10亞基的存在使得小麥品種具有優良的面包品質，Glu-D1位點上的亞基對面包的品質的影響最為顯著，y型HMW-GS的相對含量對面團拉伸阻力和能量、面包體積和面包外觀等面包品質的影響大于x型。在相同低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)背景下，金 慧等[24]研究HMW-GS對面團流變學特性和面包加工品質的影響，結果發現，HMW-GS對延展性的影響不顯著，而對面團強度、不溶性谷蛋白聚合體和面包加工品質的影響顯著，其中對面團強度效應大小為Glu-D1>Glu-B1>Glu-A1，對面包加工品質效應大小為Glu-D1>Glu-A1>Glu-B1，Glu-D1位點亞基對面包品質效應貢獻最大，這與Horvat等[23]研究結果基本一致。就單個亞基而言1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By9、1Bx17+1By18和1Dx5+1Dy10對小麥品質影響較大，而1Ax1/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy10亞基組合為品質改良的最佳組合。張金乾等[25]對隴東地區小麥資源的HMW-GS組成和品質分析，發現攜帶1Ax2*/1Bx7+1By9/1Dx5+1Dy12亞基組合的小麥品種(系)綜合品質性狀較優。張自陽等[26]研究發現，國外引進種質和黃淮冬麥區種質的HMW-GS亞基類型較為豐富，且優質亞基出現的頻率較高，1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18、Dx5+1Dy10亞基對面筋強度和面團穩定時間均具有明顯的正向效應；1Ax2*、1Bx17+1By18、Dx2+1Dy10亞基對饅頭的硬度和咀嚼性具有明顯的正向效應，攜帶1Bx14+1By15亞基材料的濕面筋含量較高，但面團穩定時間較短，而攜帶1Bx17+1By18亞基材料的面團穩定時間較長，且饅頭的硬度和咀嚼性均較好。本研究發現，1Ax1、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18、Dx5+1Dy10亞基對蛋白質含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力和拉伸面積等品質性狀有顯著正向效應，而1Bx14+1By15亞基對除蛋白質含量和濕面筋含量以外的其他品質性狀有負向效應，這與張自陽等[26]研究認為1Bx14+1By15是優質亞基，對面包、面條和餃子等面制品的品質具有重要影響的結果不同，這可能是由于二者所選用試驗材料和品質分析方法不同所致。本研究進一步分析發現，攜帶1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品種(系)的蛋白質含量、沉降值、吸水率、穩定時間、最大抗延阻力、拉伸面積等品質性狀高于攜帶其他組合類型的品種(系)，而攜帶1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10品種(系)的各個品質性狀低于攜帶其他組合類型的品種(系)。

本研究發現，少數小麥品種(系)HMW-GS亞基組成與品質性狀表現不一致，如個別攜帶優質亞基組合的1Ax1/1Bx7+1By8/1Dx5+1Dy10品種(系)的品質性狀表現一般，而個別攜帶1Ax-null/1Bx7+1By9/1Dx2+1Dy12和1Ax-null/1Bx14+1By15/1Dx5+1Dy10的材料蛋白質含量、沉降值、穩定時間、最大抗延阻力等品質性狀反而高于攜帶優質亞基組合的材料。這可能是由于小麥品質性狀除受HMW-GS影響外，還受LMW-GS、醇溶蛋白含量、環境因素、制粉工藝及其他不同基因間調控等因素的影響，也可能是由于本試驗選用的小麥材料數量偏少，其代表性存在一定的局限性。本研究沒有發現優質亞基1Ax2*、1Bx7OE+1By8、1Bx13+1By16、1Dx5+1Dy12等，在今后的小麥優質強筋育種工作中應注重從外引小麥或近緣種屬中發現和挖掘優質HMW-GS，并加大這些優質亞基組合的育種利用，進一步豐富我國小麥種質資源的遺傳多樣性，為培育優質強筋小麥新品種提供優異育種材料。