基于GC-MS的玉米萌發過程代謝組學研究

王瑋棋， 牟美睿， 楊仁杰， 劉海學

(1.天津農學院農學與資源環境學院， 天津 300384； 2.農業農村部環境保護科研監測所， 天津 300191；3.天津農學院工程技術學院， 天津 300384)

玉米是我國三大糧食作物之一，產量僅次于水稻和小麥[1]，是重要的糧食經濟作物，也是一種健康的粗糧作物[2]，營養豐富。而在直接食用的過程中大部分營養元素不能被人體直接吸收，蛋白質等物質利用率較低[3]，需要配合多種酶分解利用。種子作為植物生命的起點[4]，其萌發過程對作物生長至關重要。目前在全球種子市場中，每年約有60億歐元的損失來自種子的發芽損失[5]。徐廣海等[6]研究表明，萌發過程中代謝活動旺盛，可以提高生物酶活性，從而增強玉米營養價值。Chavan和Kadam[7]發現，萌發可以促進玉米的蛋白質利用率，同時可以降低玉米的抗營養因子水平。種子在萌發過程中通過吸水激活新陳代謝、轉移儲備物質、產生能量，從而開始蛋白質合成(翻譯)并產生營養物質[9]，并且需要多條代謝途徑配合，如糖酵解途徑、三羧酸循環和戊糖磷酸途徑等。種子萌發的代謝過程對種子活力(發芽)及植物生長發育至關重要，逐漸成為評價植物品質的重要標準[10]。

20世紀80年代以來，對種子萌發代謝過程基本原理的認識逐漸增加，但與基因組學或蛋白質組學相比，對種子萌發的代謝組學及生物標志物方面的研究還不夠全面，同時對玉米種子萌發的研究主要集中在種子萌發的生理變化、營養成分及遺傳機制方面[11-13]，對萌發過程的代謝過程研究較少。因此，本研究以玉米為試驗材料，利用氣相色譜質譜聯用技術測定種子不同萌發階段的相關代謝產物，明確種子不同萌發階段的代謝物差異，研究萌發階段的代謝物動態變化及代謝調控，試圖進一步探索玉米種子萌發過程中營養物質的吸收變化規律，為進一步提高玉米糧食品質及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用華農138玉米種子為供試材料，由天津農學院農業分析測試中心提供。

1.2 試驗設計

按照GB/T 3543.4—1995標準萌發試驗規程，選取籽粒飽滿的玉米種子，用5%次氯酸鈉浸泡15 min，去離子水沖洗3次后采用紙培法置于發芽盒中，置于恒溫培養箱中進行發芽試驗，于8 h(A)、36 h(B)、80 h(C)、108 h(D)分別取樣液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中待測，3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品制備

將玉米樣品經液氮冷凍后研磨至粉末，稱取150 mg加入體積比為1∶1∶1的乙腈-異丙醇-水混合溶液，超聲提取35 min(40 kHz，4 ℃)后10 000 r·min-1離心1 min，取上清液100 μL氮氣吹干。

1.3.2衍生化處理

取10 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg·mL-1)加入樣品中置于30 ℃恒溫90 min后，向樣品中加入30 μL衍生劑(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒溫30 min，最后加入1 mL溶劑正庚烷(含20 μg·mL-1內標物十一烷)過0.22 μm濾膜，轉入GC進樣瓶待上機。

1.3.3GC-MS測定

試驗儀器采用美國Aglient公司7890 A-5975 C型氣相色譜質譜聯用儀。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管氣相色譜柱。載氣為純度99.999%的氦氣，進樣模式不分流，進樣量1 μL。進樣口溫度250 ℃，升溫程序為先由常溫升至60 ℃維持1 min后，以10 ℃·min-1速度升至280 ℃，最后在280 ℃維持5 min。

質譜條件：電子碰撞內能為70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲4.5 min；掃描速度為2 scan·s-1，范圍為50～500 m·z-1。

1.4 數據處理

通過GC-MS光譜全波段掃描玉米種子代謝物質，Agilent-MassHunter工作站對原始數據進行特征提取，最后得到保留時間(rt)及峰面積(intensity)；導出數據至Microsoft Excel進行整理，通過SIMCA-P進行偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)，SPSS進行t檢驗(Student’s t-test)，篩選差異代謝物，利用Omicshare平臺進行聚類熱圖分析(HCA)、利用Metabo Analyst平臺進行KEGG代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 GC-MS分析及差異代謝物鑒定

2.1.1GC-MS分析

對不同萌發階段的玉米種子進行GC-MS分析，通過總離子流圖(圖1)可以看出，4份玉米材料中共掃描出116個峰，出峰時間集中在14～28 min之間，經數據庫注釋后，4份玉米種子材料中共得到56個代謝物，如圖2所示，包括19種有機酸、12種氨基酸、15種糖及衍生物和10種化合物。在有機酸和糖及衍生物中，隨著發芽時間的增加代謝物的含量及數量均表現為上升趨勢，即D>C>B>A，其中糖類變化最明顯，D較A處理含量增加了134%；在氨基酸中，B代謝物數量為A的67%，總含量僅為A的38%，而A、C、D在總體上均表現為依次上升趨勢，即D>C>A>B；在其他化合物中，隨著萌發階段的變化，含量表現為C>A>D>B，而數量變化則表現為C>D>A>B。雖然氨基酸及化合物類物質含量呈不規律變化，但代謝物總變化仍表現為代謝物含量及數量隨著萌發時間的增加而增加，對比萌發初期，其他萌發階段代謝物含量均在一定程度上有積累。

2.1.2差異代謝物鑒定

為鑒別玉米籽粒不同萌發階段的差異代謝物，對代謝物含量歸一化處理后進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分圖(圖3)，R2=0.984，Q2=0.997，同時為防止模型過擬合進行交叉驗證后所有點均小于原始R2，說明模型擬合較好且具有可行性。通過得分圖可以看出，該方法能較好的將不同萌發階段的玉米籽粒區分開，進而得出投影變量投射重要度(Variable Importance for the Projection，VIP)(圖3)，圖中柱子高度越高差異越顯著[14]，結合PLS-DA與方差分析(one-way ANOVA)篩選差異代謝物(VIP>1且p<0.05)[15]。最終得出15種差異代謝物(表1)，分別為有機酸(6種，40%)、氨基酸(4種，27%)、糖類及其衍生物(1種，6%)、其他化合物(4種，27%)。

表1 玉米不同萌發時期差異代謝物

2.2 差異代謝物分析

2.2.1差異代謝物聚類分析

利用Omicshare軟件根據代謝物含量鑒定篩選出的差異代謝物，對不同萌發階段玉米籽粒進行代謝物和萌發階段兩個維度的聚類熱圖分析(HCA)，如圖4所示，橫坐標代表不同萌發階段，縱坐標代表差異代謝物，其中紅色表達代謝物顯著上調，相應藍色代表顯著下調，圖中A、C、D聚在一支，其中A較D存在更多有機酸類物質的積累，C較A、D存在顯著的醋酸及膽固醇積累。與其相比B中可以觀察到顯著上調的糖、有機酸和氨基酸的積累，說明篩選出的差異代謝物能將不同萌發階段的玉米籽粒區分開來，同時不同萌發階段的差異代謝物經過聚類也能明顯區分，說明不同代謝物在響應不同萌發階段途徑上存在顯著差異。

2.2.2差異代謝物含量變化

碳水化合物、蛋白質和脂肪類物質作為種子中的重要組成部分，其代謝產物糖類、有機酸、氨基酸分別在代謝過程中發揮重要作用。通過對不同萌發時期種子中不同差異代謝產物進行分析可以看出(圖4)，糖類物質在種子吸水膨脹階段(B階段)含量顯著增加，氨基酸類物質則隨著種子萌發過程的推進，含量逐漸降低，當種子達到D階段即發芽結束后，氨基酸含量又有所回升，而有機酸及其他化合物則表現為在萌芽初期存在一定含量，隨著萌發過程的推進，在種子胚芽伸長階段(B階段)其含量下降到最低水平后，有機酸和化合物含量繼續攀升，在種子發芽基本完成后(C階段)達到最高水平，隨后逐漸降低。

2.3 KEGG通路分析

將篩選出的差異代謝物導入Metabo Analyst，得到代謝通路氣泡圖(圖5)，其中氣泡大小代表影響因子大小，氣泡越大影響因子越大；顏色深淺代表P值大小，顏色越深P值越小，小分子代謝物積累程度越高[16]。同時利用拓撲Fenix進行通路分析，經分析映射出13條可能的代謝通路(表2)，代謝途徑6條，生物合成途徑5條，轉化途徑1條，降解途徑1條。其中5條與有機酸有關，3條與氨基酸有關，可見不同萌發階段主要對玉米籽粒中的氨基酸及有機酸類物質產生影響。經分析后篩選得出1條具有顯著意義的途徑(p<0.05或Impact >0.2)，為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，這條途徑與氨基酸代謝有關，有兩個差異代謝物富集到此途徑上，分別為甘氨酸和絲氨酸。

表2 代謝通路富集結果

3 結論與討論

種子萌發作為植物生長發育中最初階段也是關鍵階段[4]，萌發過程中種子中的貯藏物質隨著代謝過程不斷發生變化，直接影響種子中代謝物的積累，來吉祥等[17]研究表明，萌發可以提高谷豆類作物中營養物質的利用率，同時降低種子中的有害物質。玉米作為重要的雜糧糧食作物，其中的糖類及蛋白質類等營養物質的利用率較低，董艷等[18]研究表明，經發芽處理后的雜糧營養結構及保健功能可以得到一定程度的提高。

本研究利用氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)結合生物統計學方法對玉米種子華農138萌發過程中的四個階段(8 h、36 h、80 h、108 h)進行代謝組學分析，對比萌芽初期階段，其余發芽過程中的代謝產物含量均有增加，其中糖類變化最為明顯，糖類作為淀粉物質的主要分解產物，在種子萌發初期發揮重要作用，糖類物質參與的糖酵解等代謝途徑是種子萌發的主要能量來源[19]，在本研究中，對篩選出的15種差異代謝物進行分析，糖類物質在種子萌發初期萌動階段含量顯著增加，這與薛梅真等[10]對玉米萌發初期可溶性糖代謝機制研究結果一致。脂肪作為種子中的重要儲能物質，其在種子萌發過程中提供的能量來源為淀粉或蛋白質類物質的2倍[20]，在種子萌發的過程中，脂肪通過水解等方式轉化為甘油、脂肪酸等有機酸類物質參與代謝途徑，為發芽提供能量。本研究中，在不同萌發階段篩選出的差異代謝物存在6種有機酸，共參與了5條差異代謝途徑，隨著種子萌發吸脹進程的推進，細胞不斷吸水破裂導致脂肪類有機酸外滲[20]，種子中有機酸含量不斷降低，在萌動階段達到最低水平，隨后含量增加在發芽階段達到最高值后逐漸下降，這與油料作物種子萌發過程中脂肪酸的變化趨勢相同[21]，由于在種子的萌發過程中，萌動階段通過糖酵解途徑提供的能量不足以滿足發芽階段種子的生命活動需要，脂肪在萌發階段水解通過乙醛酸循環、丙酮酸代謝等途徑不斷轉化為小分子有機酸類物質，為種子繼續提供能量。蛋白質作為玉米種子中的重要物質基礎，其降解產物氨基酸是人類生命活動所必需的，有研究表示，種子的萌發過程可以有效改善作物中的氨基酸含量，同時提高人體所需的必需氨基酸指數[22]，在本研究中，差異代謝物中存在4種差異氨基酸參與了3條代謝途徑，其中甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝途徑具有顯著意義，同時差異氨基酸在玉米種子的吸脹階段含量水平較高，而隨著發芽進程的推進含量不斷降低，在發芽階段含量達到最低值，隨后在成苗階段攀升至最高水平，說明種子在萌發過程中，氨基酸類物質在種子吸水激活后不斷為種子的呼吸氧化過程提供碳源及氮源[23]。

本研究通過對玉米種子萌發過程不同階段(吸脹階段、萌動階段、發芽階段、成苗階段) 代謝物含量進行差異分析，發現在玉米種子發芽過程中，差異代謝物主要集中在有機酸、氨基酸及糖類物質，存在一條氨基酸代謝途徑具有顯著意義，在玉米種子發芽初期的吸脹、萌動階段糖類物質水平最高，提供主要能量來源，而當到達發芽階段種子中的脂肪降解提供能量，有機酸含量達到最顯著水平，而在種子萌發的全過程中，氨基酸含量逐漸降低，當發芽完成后成苗階段，氨基酸水平達到最高。本研究利用代謝組學手段研究了不同萌發階段種子中代謝物含量差異，完成了不同萌發階段的差異代謝物篩選及代謝通路鑒別，這可以為提高玉米中營養利用率及發展高效優質玉米品種提供一定的理論參考。