涉案罌粟種子微形態及其活力特征研究

劉大偉， 應耿迪， 趙靜怡， 謝春平

(1.南京森林警察學院刑事科學技術學院， 江蘇 南京 210023；2.國家林業局森林公安司法鑒定中心， 江蘇 南京 210023)

根據我國《刑法》第352條的規定“非法買賣、運輸、攜帶、持有未經滅活的罌粟等毒品原植物種子或者幼苗，數量較大的，處三年以下有期徒刑、拘役或者管制，并處或者單處罰金”。因此，涉案罌粟(PapaversomniferumL.)種子是否具有活力是該罪名判定的重要依據之一。罌粟隸屬于罌粟科(Papaveraceae)罌粟屬(PapaverL.)，含有豐富的生物堿，是鎮痛藥、鎮咳藥和解痙藥的重要成分，在我國已有數百年的使用歷史。但過度和不當使用會造成嚴重的成癮性，因此也成為濫用最廣、毒性最強、危害最大的違禁麻醉品之一[1]。毒品問題是政府層面開展社會治理，保障社會穩定、經濟發展、國家安全的重要治理領域[2]；我國政府長期致力于毒品犯罪的大力打擊并取得了顯著的成效[3]。因此，切斷毒品原植物的種植與傳播，是打擊毒品犯罪的重要手段之一。

罌粟的鑒定除了莖、葉、花、果實等常規的表型依據外，種子是其分類屬性的重要判別依據。相比于其他植物形態器官而言，種子在封閉的環境中發育形成后，其表型特征趨于穩定，尤其是種皮表面的紋飾，它可作為物種鑒定和植物分類的一個重要依據[4-5]。由于每個罌粟蒴果內含有數千粒細小的種子，每一粒種子都有可能發育形成成熟的個體，從而導致毒品原植物的泛濫，因此，檢驗涉案罌粟種子是否具有活力也是毒品原植物鑒定工作的另外一個重要方面。種子發芽是一個復雜的生物過程，受各種環境和遺傳因素的影響[6]，被認為是植物生命周期中最關鍵的時期之一[7]。一般而言，當通氣條件不受限制時，溫度和水分主要決定種子發芽的速度[7]；而當水分充足時，活種子樣品的發芽率和最終發芽率均會受到溫度的直接影響[9]。研究表明，罌粟種子的最適宜發芽溫度為18 ℃[10]；國家林業局森林公安司法鑒定中心自成立以來已受理了數百起毒品原植物罌粟種子及其活力鑒定的案件，長期的罌粟種子活力檢驗鑒定工作經驗也表明罌粟種子在20 ℃左右較易發芽。由于送檢的涉案罌粟種子來源特殊及復雜，如何有效地檢驗這些種子活力以及后期如何做滅活處理等，均是司法鑒定工作過程中需要思考的問題。

基于此，本研究對不同年份送檢的罌粟種子進行發芽實驗，在測定不同年份罌粟種子的發芽率、發芽勢、發芽指數等多項指標的基礎上，探討罌粟種子活力的衰減情況，旨在為涉案罌粟種子活力檢驗時間的確定、種子滅活處理等方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料來自2013—2020年期間各級公安機關送檢的涉案罌粟種子。上述種子均放置在密閉的塑料自封袋內，常溫儲存，無任何特殊處理。

1.2 實驗方法

1) 種子的測定及微形態

對不同年份送檢的罌粟種子各隨機選取30粒，用精度0.001 mm的電子游標卡尺分別測量種子的長度、寬度和高。利用千分天平(精度為0.001 g)測定百粒重，重復10次。

利用手持電子顯微鏡(0～200倍放大)對供試罌粟和虞美人(PapaverrhoeasL.)種子的表皮進行微形態觀察。

2) 種子發芽

2020年8—10月在國家林業局森林公安司法鑒定中心實驗室進行試驗，所有實驗過程及樣本均受到嚴格控制。提取歷年送檢的罌粟種子，每個年份做4個重復，每個重復提取100粒種子，做好年份及重復的播種標記。首先將材料放置在100目的紗布上進行簡單的沖洗，將果殼、殘葉等雜質去除。其次將每份材料放置在0.1%的KMnO4溶液中浸泡10 min，用自來水沖洗干凈。在培養皿底部鋪墊一層醫用棉花，覆蓋濾紙，并將棉花和濾紙用蒸餾水浸濕潤，然后點播上實驗用罌粟種子，放置在20 ℃全光照恒溫培養箱中培養。放置72 h后，每天17：00時開始逐一記錄種子發芽情況。當胚根>2 mm視為種子發芽，反之視為種子未發芽[11]。當連續3 d未見有新發芽種子，則視為發芽結束[12]。實驗結束后，所有材料均用NaOH溶液浸泡進行滅活處理。

3) 項目測定

發芽率(%)=(發芽種子數/供試種子總數)×100%；

發芽勢(%)=(規定天數內種子發芽數/供試種子總數)×100%；

發芽指數=∑(Gt/Dt)，其中Gt為在t日當天的發芽數，Dt為發芽日數[13]。

供試種子數為100粒，種子發芽勢統計時間為播種后的第7天。

1.3 數據處理

所有測定結果均以平均值±標準差的方式表示；利用IBM SPSS 22.0軟件對不同年份涉案罌粟種子的各項數據進行單因素方差分析和差異顯著性分析(LSD)；利用皮爾森相關系數檢驗不同指數間的相關性。利用Excel 2010軟件進行數據整理、繪圖與擬合回歸方程。

2 結果與分析

2.1 罌粟種子微形態特征

罌粟和虞美人不論是花果還是種子形態特征，均具有一定的相似性(圖1)。從圖1 a可以看出，罌粟種子整體上多數呈腎形，較為豐滿圓厚。罌粟的種子長為0.85～1.1 mm，寬為0.75～0.85 mm，高為0.65～0.75 mm。種子外具有蠟質層，種皮呈褐色、灰褐色、黃褐色或淺黃等，但多數種子以深色為主。種皮具有明顯的網眼狀結構，網眼邊緣明顯凸起；多數網眼呈規則或不規則的五邊形或六邊形，少數出現四邊形的情況；同時，在各網眼內還分布有大小不一、形狀各異的網紋孔。種臍位于種子凹縮處，淺褐色，呈海綿狀。

從圖1 b可以看出，虞美人種子的基本形態與罌粟具有相似的腎形結構，但其在種子中間凹縮程度較小；部分虞美人種子呈現出三角狀、卵形、橢圓形等情況。虞美人的種子較罌粟明顯小，長0.65～0.90 mm，寬0.50～0.70 mm，高0.40～0.50 mm。種子外也具有蠟質層，種皮有淺褐色、淺黃色或灰黃色，整體顏色以偏黃褐為主。種皮網眼結構在顯微鏡下清晰可見，網眼邊界凸起明顯；多數網眼呈四邊形或五邊形，幾乎無六邊形的情況；網眼的排列也較為整齊。在普通顯微鏡觀察下，網眼內的網紋結構模糊可見或較不明顯。種臍位于種子凹縮處，淺灰色或白色，呈海綿狀。

2.2 不同年份涉案罌粟種子形態變化

表1所列為不同送檢年份涉案罌粟種子的形態及重量特征。2013—2020年送檢的罌粟種子的百粒重分別為0.027 g、0.024 g、0.031 g、0.031 g、0.030 g、0.035 g、0.036 g和0.032 g。整體上現呈出時間間隔越長種子越輕的情況，其中2019年送檢的種子的百粒重平均值最大為0.036 g；但2020年種子的百粒重與其他年份差異顯著(p<0.05)。不同送檢年份的罌粟種子長分別為0.872 mm、0.934 mm、0.942 mm、0.932 mm、0.991 mm、1.013 mm、0.955 mm、0.883 mm，其中最長的是2018年的種子，為1.013 mm。從種子的寬來看，不同年份值分別為0.745 mm、0.748 mm、0.784 mm、0.820 mm、0.802 mm、0.767 mm、0.798 mm和0.728 mm，最寬的是2016年送檢的種子，為0.820 mm。從種子的高來看，不同年份值分別為0.653 mm、0.689 mm、0.658 mm、0.714 mm、0.743 mm、0.732 mm、0.769 mm和0.704 mm，最高的是2019年送檢的種子，為0.769 mm。因此，從上述數據可以看出，雖然不同送檢年份之間罌粟種子的形態數量特征存在一定的差異性，但并未有特定年份種子的差異特別顯著，這與百粒重僅為2020年顯著差異有明顯區別。

表1 不同送檢年份涉案罌粟種子的形態及重量特征

2.3 不同年份涉案罌粟種子發芽特征

由圖2 a可見，以連續3 d未見有新發芽種子為實驗結束。除2019年的種子發芽時間較短外(9 d)，其余各年的發芽時間均在10 d以上。從發芽初始時間來看，近3年種子發芽的初始時間均在4 d內開始，而2013年的樣本則在第10天才出現發芽的跡象；因此送檢的罌粟種子年份越長初始發芽時間越晚，發芽延續時間也越長。

發芽率是種子活性的最基本體現，它反映了種子在適宜條件下能夠長成正常植株的能力，可以直接反映種子的生活力[14]。從圖2 b可以看出，不同年份送檢的罌粟種子隨著時間的延長，發芽率呈降低的趨勢，這種趨勢符合曲線方程y=0.061 5x2-14.478x+118.79，R2=0.912 8。從圖2 b還可以看出，2018—2020年的發芽率均在90%以上，其中以2019年最高為(96.3±2.49)%；隨著年限延長，在2013年的發芽率最低，為(9.7±0.94)%。不同年份發芽率差異性檢驗表明，近3年涉案罌粟種子之間的發芽率無明顯差異，但與其他年份有顯著差異(p<0.05)；同時2013年、2014年、2017年的樣品之間也存在顯著差異。

發芽勢主要有根據日發芽種子數達到最高峰計數[14]或指定時長計數[15]兩種方法，本研究根據后者在第7天計算各年份罌粟種子發芽勢。由圖2 c可知，不同送檢年份的罌粟種子發芽勢之間的關系符合曲線方程y=1.291 7x2-24.597x+110.63，R2=0.714 3。從整體趨勢看出，發芽勢的變化與發芽率近似，即送檢年份越短發芽勢表現越高，隨著送檢年限增加發芽勢呈下降趨勢；而2018—2020年的近3年的發芽勢與其他年份有顯著差異(p<0.05)。

從圖2 d可以看出，2019年樣品的發芽指數最高，為97.3±18.5，然后逐年降低到2013年的3.0±0.5。近3年的發芽指數依然是最高的，它們與其他年份的樣品有顯著差異(p<0.05)。不同年份的發芽指數之間的關系符合曲線方程y=1.008 7x2-22.669x+119.04，R2=0.898 6。

通過上述分析可知，不同年份送檢的罌粟種子的發芽過程、發芽率、發芽勢和發芽指數均存在一定的差異。皮爾森相關性檢驗的結果表明，發芽率與發芽勢(0.908，p<0.01)、發芽率與發芽指數(0.968，p<0.01)、發芽勢與發芽指數(0.962，p<0.01)均存在極顯著正相關。

3 結論與討論

由于受微環境、植株個體、營養情況、年份差異等綜合因素的影響，果實及其種子的大小均會在數量特征上存在一定程度的變異[16-17]；但種子表皮特征，如紋飾、種皮顏色、種臍等均具有種內穩定性[18]，這為植物系統分類及物種鑒定提供了可靠的形態學依據，已獲得了廣泛的應用[19]。由于虞美人在園林應用中較為廣泛，且其花形態近似于罌粟，故常被非專業人士誤以為是毒品原植物罌粟；更有不法分子將兩個物種的種子進行混淆，進行非法交易。通過電子顯微鏡觀察，這兩個物種的種子雖然在形態上較為相似，但通過微形態觀察仍可較好地將兩者區別開，主要體現在以下幾點： 1) 從個體大小看，單顆罌粟種子為虞美人的1.5～2倍大； 2) 從種皮紋飾看，罌粟種子的五邊形或六邊形的網眼較多，且網眼內還清晰可見不規則的網孔結構，而虞美人則以四邊形為主； 3) 從整體形態上看，雖然兩者均以腎形為主，但罌粟種子的形態較為單一，虞美人出現其他形態更多樣； 4) 罌粟的種皮顏色以灰褐色或淡灰色為主，虞美人以偏黃褐色居多。因此，上述4個種子形態特征點可較好地區別兩者。

從不同年份送檢的罌粟種子形態數量特征來看，其長、寬、高雖然存在差異性，但未見某一年份的種子差異顯著于其他年份。不同年份涉案罌粟種子大小的影響主要受遺傳和環境因素兩方面的影響[20]。首先，實驗所獲取的種子來自不同的案發地，這就使得種子的地理分布環境存在較大的差異；其次，不同來源地的罌粟存在不同的品種類型或不同家系，這也是導致種子形態特征存在變異的重要原因之一。類似的情況在降香(DalbergiaodoriferaT. chen)[16]、桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq.) A. DC.)[21]、構樹(Broussonetiapapyrifera(Linn.) L'Hert. ex Vent.)[22]等許多植物中出現。此外，2020年送檢的罌粟百粒重與其他年份具有顯著差異，這可能是當年收種子含水率較高的原因所致。雖然與其他物種的情況類似，種子均表現出隨著儲存年份的增加，種子重量呈下降的趨勢[23]；但它們之間的百粒重差異不顯著，這可能是罌粟種子表皮的蠟質層抑制了種內水分的蒸發。種內種子形態數量特征的差異性狀是普遍存在的現象；因此，需要在具體的物種鑒定工作中加以重視，避免通過單一的數量特征來判斷種類。

隨著貯藏時間的延長、貯藏環境的變化，種子會因為自然老化或人工老化發生劣變[24]，而這種變化最直接的體現就是在種子發芽過程中發芽率、發芽勢、發芽指數等數量特征的變化。從本研究可以看出，不同年份送檢的罌粟種子在上述3個種子活力檢驗指標中均具有較明顯的變化。這3個指標統一表現出隨著存儲年份的增加，種子活力呈衰減的趨勢。一般認為，種子內的存儲物種是種子活力形成的基礎，它是在種子形成和發育過程中逐漸積累形成的；隨著種子的不斷成熟，體內的營養物質逐漸積累，種子的活力也逐漸提高，直至生理成熟期達到高峰[23]。但是，此后種子活力開始逐漸下降，尤其是種子細胞膜隨貯藏時間的增加逐漸損壞和老化[14]，種子細胞結構和功能受損傷，這個過程不可避免和逆轉[25]。因此存儲時間越長罌粟種子的活力就越低。一般種子工作者可能更關注的是種子發芽勢和發芽指數，因為它們會影響出苗率、整齊性等。但在植物法庭科學中，種子發芽率則是重點關注對象。本實驗結果表明，時間越久遠的種子初始發芽所需的時間越長，發芽率也越低。有學者對同屬的野罌粟(PapavernudicauleL.)種子長期冷凍貯藏發芽力變化進行了研究，其發芽率統計周期為7 d[26]；但本實驗部分樣品在第10天才出現發芽的跡象。因此，在對涉案罌粟種子進行活力檢驗實驗中，應適當延長實驗時間，保證在10 d以上；如若在首次未檢出活力，應注意控制和調整實驗條件，避免漏檢。