湖北楓楊水煎液誘導CIA模型大鼠滑膜細胞凋亡機制研究

陳明 向陽

【摘 要】 目的：探究楓楊誘導類風濕關節炎大鼠細胞凋亡的機制，為楓楊治療類風濕關節炎提供科學依據。方法：雄性健康SD大鼠60只，隨機分為空白組、模型組、雷公藤多苷組、楓楊水煎液低、中、高劑量組，除空白組外，其余各組建立CIA模型。造模成功后，分別給予相應治療，測量膝關節直徑，進行關節炎評分，觀察滑膜切片，檢測血清炎癥因子水平和相關凋亡蛋白的表達。結果：①一般情況：與模型組比較，各用藥組體重明顯增加，膝關節直徑、關節炎指數均有所下降，其中楓楊高劑量組效果優于雷公藤多苷組（P<0.05）。②滑膜組織病理形態觀察：HE染色結果顯示，模型組大鼠膝關節有大量炎性細胞浸潤。楓楊治療組能夠顯著緩解膝關節腫脹程度，抑制足部的紅腫，HE染色鏡下表現及評分也有所改善（P<0.05）。③ 細胞因子和相關蛋白：與模型組相比，各治療組TGF-β、IL-4水平明顯升高，IL-17A、IFN-γ水平顯著降低（P<0.05）;滑膜組織中，Bcl-xl蛋白的表達降低，Caspase-8表達增加（P<0.05）。對于TNFRII，則存在楓楊低劑量組降低，中、高劑量組明顯上調其表達（P<0.05）。結論：楓楊水煎液可有效緩解CIA大鼠臨床癥狀及病理改變，降低血清炎性細胞因子、提升抗炎因子水平，上調滑膜促凋亡蛋白、下調凋亡抑制蛋白表達，促進CIA大鼠滑膜細胞凋亡。

【關鍵詞】 楓楊;膠原誘導關節炎;滑膜細胞;凋亡

【中圖分類號】R593.22?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）17-0023-07

Mechanism of Hubei Fengyang Decoction Induced-Apoptosis of

Synovial Cells in CIA Rats

CHEN Ming1，2XIANG Yang1，2*

1.Department of Medicine，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China;

2.HubeiProvinceKey Laboratory of occurrence and intervention of RheumaticDiseases（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China

Abstract：ObjectiveTo observe the therapeutic efficacy of Fengyang on rheumatoid? arthritis and evaluate the effect of Fengyang to induce synovial fibroblast cell? apoptosis in collagen-induced arthritic （CIA） rats.Methods Sixty healthy male SD rats divided into CIA control control （CC） group，Triptery giumpoly glycoside（TG）-treating group，and three Fengyang-treating（FY） groups bred with low，medium and high dose of Fengyang decoction.After successful establishment of the model，the diameter of knee joint was measured，the score of arthritis was scored，the synovium section was observed，and the level of serum inflammatory factors and the expression of apoptosis-related proteins were detected. Results ①General conditions：Compared with the model group，the weight of rats in each medication group increased significantly，the diameter of knee joint and the arthritis index decreased，among which，the effect of the high dose group of FY was better than that of the TG group （P<0.05）.②Pathological observation of synovial tissue：The results of HE staining showed that there was a large amount of inflammatory cell infiltration in the knee joints of rats in the model group. FY groups could significantly alleviate the swelling degre of knee joint，inhibit the swelling of foot，and decrease the score of HE staining microscopy （P<0.05）.③ELISA results for cytokines and Western Blot test for apoptosis-associated protein：Compared with the model group，the levels of TGF-β and IL-4 were significantly increased and the levels of IL-17A and IFN-γ were significantly decreased in each treatment group （P<0.05）.④Western Blot test for apoptosis-associated proteins： Compared with the CC group，the expression of TNFRII in medium-dose and high-dose FY groups was significantly increased（P<0.05）;The expression of Caspase-8 protein in each drug group was significantly increased（P<0.05）;The expression of Bcl-xl protein was decreased in all medication groups（P<0.05）.Conclusion The efficacy of Fengyang in treatment of collagen-induced arthritic rats may partially obtained by inducing synovial fibroblast cell apoptosisand regulating the expression of cytokines IL-17A， TGF-β，IFN-γ，IL-4.

Keywords：Pterocarya;Collageninducearthritis;Synovialcells;Apoptosis

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關節滑膜慢性炎癥及關節的進行性破壞為主要特征，以對稱性多關節炎為主要臨床表現，常見關節處疼痛、腫脹，呈持續性、反復性發作[1-4]。若不及時治療，最終可引起關節畸形，喪失關節功能。RA的發病機制并不十分明確，滑膜細胞增殖與凋亡失衡是目前研究的重要方向。RA滑膜細胞的增殖與炎性細胞浸潤、血管翳形成、侵蝕軟骨及骨組織損傷為主要病理特征，從而導致關節結構破壞、畸形及功能喪失[5]。有研究[6]發現，RA患者滑膜細胞增生明顯，而細胞凋亡率顯著減少，卻并沒有因過度增生出現過多的細胞凋亡，提示滑膜細胞的凋亡障礙可能是導致滑膜增厚的原因之一。有研究[7-8]表明，湖北楓楊（Pterocarya Hupehensis Skan，PHS）通過影響線粒體凋亡途徑誘導RA滑膜細胞凋亡，本實驗建立CIA模型大鼠，用湖北楓楊水煎液進行干預，進一步探討楓楊對CIA大鼠膝關節滑膜凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠60只（200±20）g，購于武漢劍悅生物科技有限公司，許可證號為SCXK（遼）2015-0001。

1.2 藥材與試劑 湖北楓楊樹皮，采自湖北省恩施市清江河灘，經袁林副教授鑒定，為胡桃科Juglandaceae楓楊屬Pterocary Kunth植物。甲醇、異丙醇、冰醋酸（武漢市中天化工有限責任公司）;BCA試劑盒、HRP標記的羊抗兔二抗（武漢科瑞生物技術有限公司）;雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥股份有限公司）;牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）;大鼠IL-4、IFN-γ、TGF-β、IL-17AELISA試劑盒（酶聯生物）;β-Actin 抗體、HRP 羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）;Bcl-xl、Caspase-8（abcam公司）;TNFRⅡ抗體（美國CST公司）;RIPA裂解液、彩色預染蛋白質分子量標準（10-180kD）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術研究所）。

1.3 設備和儀器 酶標儀（Thermo公司）;電泳儀電源（北京六一生物科技有限公司）;包埋機（美國通用電氣醫療集團）;石蠟切片機（Leica公司）;化學發光成像分析儀（美國通用電氣醫療集團）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 60只大鼠適應性喂養1周，隨機選取10只作為正常組，其余50只制作CIA模型。

2.2 動物分組 將造模成功的50只大鼠，隨機分為5組，分別為模型組、雷公藤多苷組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，未造模的10只大鼠作為正常組。

2.3 給藥方案 雷公藤多苷組大鼠予以6.25mg/（kg·d）的雷公藤多苷混懸液灌服，楓楊低、中、高劑量組分別給予2.0g/（kg·d）、4.0g/（kg·d）、8.0g/（kg·d） 的水煎液灌服，正常組、模型組灌服等體積的生理鹽水，每組大鼠每天灌胃1次，連續灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃28 d后，禁食禁水12 h，待麻醉成功，打開胸腔，用采血針于心尖搏動處取血，用于ELISA法檢測血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。充分暴露大鼠雙膝關節腔，髕骨處可見一層淡黃色光滑組織，即為滑膜組織，利用手術刀及手術鑷小心對其進行剝離并分離。

2.5 一般情況 每7天測量一次體重、膝關節直徑、并進行關節炎評分，用以評價關節炎癥程度。關節炎評分按照以下標準：0分：無紅腫;1分：小趾關節紅腫;2分：趾關節和足趾腫脹;3分：踝關節以下的足爪腫脹;4分：包括踝關節在內的全部足爪腫脹。

2.6 HE染色 將組織從多聚甲醛固定液中取出，在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整，經酒精脫水、二甲苯透明，明膠浸蠟及石蠟樹脂等包埋成含有滑膜組織的石蠟塊。蠟凝固后，從包埋框中取出，并進行修整。將修整好的蠟塊置于切片機上切片，切片漂浮于攤片機溫水上將組織攤平，用載玻片將組織撈起，放入烘箱中烤片。取出切片，置于自動染色機脫蠟染色，再用中性樹膠封片。最后鏡下觀察，并進行病理學評分。關節組織病理學評分標準為：組織無病理學改變，記作0分;輕微炎癥浸潤記為1分;中度記為2分;重度，但無血管翳生成記3分;嚴重的炎癥浸潤，形成血管翳或軟骨、骨侵蝕，記4分。

2.7 ELISA法 檢測血清細胞因子水平? 按照ELISA試劑盒方法檢測血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。

2.8 Western Blot法檢測相關蛋白表達 提取滑膜蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，然后將各組蛋白煮沸，加入四分之一體積的蛋白上樣緩沖液（5×）。取適量的樣本，在凝膠中依次加入蛋白上樣緩沖液（1×），Maker，各組蛋白樣本，蛋白上樣緩沖液（1×）進行電泳。再將蛋白轉移至PVDF膜上，用3%濃度的BSA封閉1h，加入不同的一抗進行孵育：TNFRⅡ（1∶1000），Caspase-8（1∶1200），Bcl-xl（1∶1000）。過夜之后取出，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，放入二抗（1∶12000），孵育2 h，TBST溶液洗膜3次。最后進行顯色，ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以內參β-acting作為對照，得到各目的蛋白的相對表達量。實驗獨立重復3次。

2.9 統計學處理 所有數據用SPSS 24.0軟件進行處理，均以均數加減標準差（x±s）的形式表示，樣本均數用t檢驗進行比較，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05則差異有顯著性意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態較好，體重明顯增加，皮毛順亮，飲食正常，足部皮膚無紅腫情況，活動自如。模型組大鼠體重增長較正常組緩慢，皮毛較為暗淡枯槁，活動量明顯減少，足部皮膚發紅腫起，關節活動受限。各治療組大鼠關節腫脹程度均有所降低，飲食量略有增加，體重逐漸增長，足部皮膚情況也有所改善。

3.2 體重變化 與正常組比較，模型組大鼠體重增長緩慢。用藥后，各治療組大鼠體重均有所增加，楓楊中、高劑量組和雷公藤多苷組體重增長明顯（P<0.05），楓楊低劑量組在用藥2周后體重明顯增加（P<0.05）。如圖1所示。

3.3 楓楊水煎液對CIA模型大鼠膝關節直徑的影響 模型組與正常組相比，關節直徑明顯增大（P<0.05），治療1周后，各用藥組與模型組比較，關節直徑有所減小（P<0.05），到第4周發現，關節直徑明顯減小（P<0.05）。與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組對大鼠關節腫脹的改善更為顯著（P<0.05）。如圖2所示。

3.4 楓楊水煎液對CIA模型大鼠關節炎指數的影響 模型組與正常組比較，有顯著性差異（P<0.01），且模型組數據上升，提示造模成功。治療1周后，雷公藤多苷組和楓楊高劑量組與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05），治療2周以后，各治療組與模型組相比，有顯著性差異（P<0.05）。且與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組對關節炎指數的改善有顯著效果（P<0.05）。如圖3所示。

3.5 楓楊水煎液對CIA模型大鼠關節滑膜的影響 與正常組比較，模型組大鼠滑膜病理評分明顯升高（P<0.05），與模型組比較，各用藥組病理評分明顯降低（P<0.05），與雷公藤多苷組相比，楓楊高劑量組改善病理方面更為顯著（P<0.05），如圖4所示。鏡下可見：正常組大鼠滑膜組織中無明顯病理變化，模型組出現大量炎性細胞浸潤，滑膜細胞增多，且呈現多層，達到5～6層甚至更多。各用藥組與模型組相比，滑膜增生，炎性細胞浸潤有所緩解，層數也有所減少，而楓楊高劑量組效果最為明顯，如圖5所示。

3.6 楓楊水煎液對CIA大鼠血清炎性因子水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中 TGF-β、IL-4含量明顯降低（P<0.05），IFN-γ、IL-17A含量明顯升高（P<0.05）;與模型組相比，各用藥組大鼠TGF-β、IL-4水平明顯提高（P<0.05），IFN-γ、IL-17A顯著降低（P<0.05）;與雷公藤多苷組相比，低劑量組對TGF-β含量的升高和IFN-γ的降低更為明顯（P<0.05），高劑量組對IL-17A水平的降低和IL-4的升高更為明顯（P<0.05）。如圖6所示。

3.7 楓楊水煎液對CIA模型大鼠凋亡相關蛋白表達的影響 與正常組相比，CIA大鼠TNFRⅡ、Bcl-xl的蛋白表達顯著增加（P<0.05），Caspase-8的表達顯著降低（P<0.05）。與模型組比較：雷公藤多苷組和楓楊低劑量組大鼠的TNFRⅡ表達明顯降低（P<0.05）;楓楊中、高劑量組TNFRⅡ表達反而明顯升高（P<0.05）;楓楊低、中、高劑量組Caspase-8蛋白表達顯著增加（P<0.05），且均顯著高于雷公藤多苷組（P<0.05）;各用藥組Bcl-xl蛋白表達均降低，其中楓楊低劑量組差異有顯著性意義（P<0.05）;楓楊低劑量組Bcl-xl表達水平顯著低于雷公藤多苷組（P<0.05）。如圖7所示。

4 討論

細胞凋亡有兩個途徑：內源性途徑和外源性途徑[9]。線粒體是發生內源性途徑的重要細胞器，而細胞表面死亡受體是介導含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-8（Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8）激活的外源性途徑[10]。外源性途徑中，死亡受體激活的起始Caspase是Caspase-8，Caspase-8可通過激活Caspase-3執行凋亡。另外，還能夠切割細胞基質中的B細胞淋巴瘤（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族成員Bid前體[11]，形成截斷的Bid（tBid），tBid可進入線粒體中，并促使Bax等蛋白產生寡聚反應，誘導細胞色素C（Cytochrome C，Cyt-C），同時使凋亡誘導因子AIF及其他相關凋亡信號從線粒體釋放，進而誘導細胞凋亡[12]。研究發現楓楊水煎液可使大鼠滑膜組織凋亡誘導蛋白Caspase-8表達增加，凋亡抑制蛋白Bcl-xl表達降低。結合前期研究結果，說明楓楊能夠通過上調Capase-8并作用于Caspase-3和B細胞淋巴瘤-xl（B-cell lymphoma-xl，Bcl-xl）蛋白，引起Cyt-C和其他凋亡信號的釋放增加，從而促進滑膜細胞凋亡。

腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）在免疫系統及相關疾病中發揮重要作用，包括Ι型（TNFRΙ）和Ⅱ型（TNFRⅡ）。腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）可分別與TNFRΙ和TNFRⅡ結合，介導不同的生物學活性[13]。在正常生理情況下，TNF-TNFRs系統保持凋亡與增殖兩方面功能的平衡，病理條件下，介導兩條相反的信號通路，會破壞這種平衡，導致機體免疫環境與功能紊亂，引起滑膜組織增生與炎癥，發生疾病。體外分別培養RA患者與正常人的成纖維滑膜細胞[14]，發現與健康人相比，RA患者的滑膜細胞增生是通過上調TNFRΙ，下調TNFRⅡ表達，來激活TNFR相關因子，導致核轉錄因子-κB（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）進一步活化，阻礙細胞的正常凋亡，造成滑膜細胞過度增殖，組織增生。Blüml研究[15]發現，TNFRΙ是關節炎發生的主要原因，而同時存在的TNFRⅡ對關節炎有保護作用。TNFRⅡ胞內不存在死亡結構域[16]，但是能夠募集腫瘤壞死因子受體相關因子2（TNF receeptor associated factor 2，TRAF2），激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB信號通路，發揮抗炎作用。

實驗結果顯示，楓楊干預CIA大鼠后，低劑量組下調TNFRII，與雷公藤多苷作用相似;而中、高劑量則對TNFRⅡ有上調作用，與雷公藤多苷完全相反。楓楊對TNFRII明顯的雙向調節現象的機制與意義尚不清楚，但值得進一步研究。考慮到TNFRII對關節炎癥的保護作用，推測中、高劑量楓楊通過上調TNFRⅡ表達，與TNFRΙ競爭TRAF2，從而促進滑膜細胞凋亡，同時抑制NF-κB信號通路上的炎癥因子的釋放，參與抗炎通路中的炎癥反應過程。這一發現對選擇楓楊治療劑量具有重要參考價值。前期細胞實驗結果顯示，湖北楓楊可通過調控相關蛋白的表達，影響線粒體凋亡途徑，從而誘導MH7A細胞凋亡。本研究對前期實驗進行了延伸，在動物水平進行研究，證實在湖北楓楊對CIA大鼠滑膜細胞的凋亡具有促進作用，其機理可能是通過調節凋亡相關蛋白TNFRⅡ、Bcl-xl和Caspase-8的表達實現的。

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（收稿日期：2021-01-13 編輯：劉 斌）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No.81260458;No.81360672）。

作者簡介：陳明（1993-），男，漢族，碩士研究生，研究方向為中醫內科學。E-mail：274115617@qq.com

通信作者：向陽（1961-），男，土家族，博士，教授、碩士生導師，研究方向為風濕免疫性疾病。E-mail：xiangy1961@126.com