大腸菌群盲樣考核結(jié)果分析

張 楊

（廣元市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川廣元 628000）

大腸菌群是世界上大多數(shù)國(guó)家和組織評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要安全性指標(biāo)之一，因和腸道致病菌有密切的相關(guān)性，大腸菌群在食品微生物指標(biāo)體系中占有重要地位，被稱為糞便污染指示菌[1]。2020年度四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局組織開(kāi)展食品安全監(jiān)督專項(xiàng)抽檢，其中28批次大腸菌群不符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，主要不合格產(chǎn)品為瓶裝飲用水、糕點(diǎn)、調(diào)味品、餐具等。大腸菌群超標(biāo)反映出食品企業(yè)衛(wèi)生狀況不達(dá)標(biāo)，可能與加工原料受污染、產(chǎn)品的滅菌不徹底、衛(wèi)生操作規(guī)范執(zhí)行不嚴(yán)格、包裝材料受污染等原因有關(guān)[2]。食品微生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目包含大腸菌群檢驗(yàn)，是絕大部分食品都會(huì)要求檢驗(yàn)的項(xiàng)目。檢驗(yàn)大腸菌群方法有很多種，本次盲樣考核要求采用平板計(jì)數(shù)法，適用于大腸菌群含量較高的食品。

1 材料與方法

1.1 盲樣來(lái)源和保存

由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心下發(fā)玻璃瓶包裝的凍干塊狀樣品，樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，按盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求立即放入-15 ℃以下的冰箱中保存。

1.2 培養(yǎng)基試劑和儀器設(shè)備

本次盲樣考核中使用的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（以下簡(jiǎn)稱VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（以下簡(jiǎn)稱BGLB）均由青島海博生物技術(shù)有限公司提供，并進(jìn)行性能試驗(yàn)且在有限期內(nèi)，符合使用要求。

生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、生物安全柜等。

1.3 方法

按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)[3]。

1.3.1 樣品制備

需要用總計(jì)40 mL滅菌生理鹽水再水化，即本次凍干的樣品等同于40 mL的食品樣品。首先從冰箱中取出盲樣使其達(dá)到室溫后，將西林瓶無(wú)菌開(kāi)啟，立即加入4 mL滅菌生理鹽水進(jìn)行再水化，凍干塊狀樣品溶解后，放入準(zhǔn)備的無(wú)菌錐型瓶中，再反復(fù)用余下的生理鹽水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無(wú)菌錐型瓶中，此溶液為待測(cè)樣品原液[4]。

1.3.2 樣品稀釋

用無(wú)菌吸管吸取25 mL待測(cè)樣品原液，放入盛有225 mL無(wú)菌生理鹽水中振搖，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 mL注入9 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，混合均勻，制成1∶100的樣品勻液，按上述操作以此類推稀釋至1∶10 000。每稀釋一次，換一根無(wú)菌吸管。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板計(jì)數(shù)

吸取1∶10～1∶10 000稀釋度樣品勻液1 mL于無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)無(wú)菌平皿，同時(shí)取1 mL無(wú)菌生理鹽水加入無(wú)菌平皿中作空白對(duì)照。將平皿中倒入融化并恒溫46 ℃的VRBA瓊脂15～20 mL，并小心轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻，待瓊脂凝固后，再加入3～4 ml VRBA覆蓋平板表層，翻轉(zhuǎn)后置于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 平板計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

2.2 菌落的選擇和證實(shí)試驗(yàn)

經(jīng)培養(yǎng)后，VRBA平板上均出現(xiàn)0.5～3 mm紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的菌落。由表1可知，只有1∶1 000稀釋度的菌落數(shù)在計(jì)數(shù)范圍之內(nèi)，從1:1 000稀釋度的兩個(gè)VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落分別接種到BGLB肉湯管中，（36±1）℃培養(yǎng)48 h后10支BGLB肉湯管均出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象。

2.3 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

該盲樣的大腸菌群數(shù)為：

40×10/10 ×103mL=4.0×104CFU/mL。

2.4 項(xiàng)目結(jié)果評(píng)價(jià)

本次食品中大腸菌群（定量）檢測(cè)項(xiàng)目盲樣考核結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

3 結(jié)論與討論

（1）參加考核前，要認(rèn)真閱讀盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，按其要求對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行前處理。由于食品中微生物的數(shù)量和種類會(huì)隨著環(huán)境的改變而出現(xiàn)消長(zhǎng)，故食品微生物盲樣樣品很少提供食品實(shí)物，多數(shù)為人工模擬樣品的凍干粉形式出現(xiàn)。對(duì)于定量項(xiàng)目來(lái)說(shuō)凍干塊的樣品為一個(gè)樣品單元，它是一個(gè)不可分割的整體，不能僅用一部分來(lái)檢驗(yàn)，其次樣品的均勻性也會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成直接影響，因此要在無(wú)菌條件下將樣品充分混勻后隨機(jī)取樣。

在日常檢驗(yàn)工作中首先需根據(jù)產(chǎn)品選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，若食品中大腸菌群含量較低，可選擇半定量計(jì)數(shù)MPN法，而大腸菌群較多的食品則可以選擇定量計(jì)數(shù)平板法[5]。其次，要選擇合適的稀釋度，稀釋度越高，檢驗(yàn)人員的工作量越大，稀釋度選擇太低，平板上的菌落數(shù)又多不可計(jì)算。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）中要求選擇2～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，但作為盲樣考核，為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要根據(jù)實(shí)際情況多選擇幾個(gè)稀釋度，同時(shí)檢驗(yàn)過(guò)程中盡量選取雙人雙平行同步檢驗(yàn)，減少人員誤差。

（2）培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)微生物檢出的準(zhǔn)確性起重要作用，使用培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）進(jìn)行制備和驗(yàn)證。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂作為選擇性培養(yǎng)基是不需要進(jìn)行滅菌的，煮沸2 min即可使用，該培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，不得超過(guò)3 h。在檢驗(yàn)過(guò)程中，為防止有遷徙性細(xì)菌生長(zhǎng)蔓延，對(duì)觀察結(jié)果造成影響，必須待第一次傾注的VRBA凝固后，再將其覆蓋一層，其目的是隔絕空氣，降低需氧菌生長(zhǎng)速度。

為了提高大腸菌群的檢出率這就要求平時(shí)要多觀察VRBA平板上大腸菌群的不同形態(tài)，并挑取菌落進(jìn)行BGLB肉湯管證實(shí)試驗(yàn)，這樣才能對(duì)大腸菌群的各種形態(tài)了然于心，防止檢驗(yàn)工作中錯(cuò)檢漏檢。

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，為了降低檢驗(yàn)過(guò)程中的誤差，挑取菌落時(shí)需注意典型菌落和可疑菌落的比例。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）要求選取菌落數(shù)在15～150 CFU的平板，挑取10個(gè)不同類型典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行BGLB發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，但是并未說(shuō)明每個(gè)平板挑取10個(gè)還是兩個(gè)平板總共挑取10個(gè)。如果平板上菌落形態(tài)單一，則兩個(gè)平板總共挑取10個(gè)進(jìn)行驗(yàn)證，若平板上菌落形態(tài)差異較大，則最好是每個(gè)平板上挑取10個(gè)菌落進(jìn)行驗(yàn)證，并且對(duì)典型和可疑菌落按照比例挑取驗(yàn)證，最終計(jì)算結(jié)果時(shí)，還需要分別計(jì)算典型菌落的陽(yáng)性率和可疑菌落的陽(yáng)性率。

提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制是為了確保檢驗(yàn)工作的準(zhǔn)確性，為產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。積極參加盲樣考核和能力驗(yàn)證活動(dòng)，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力和管理狀況進(jìn)行考核的方法之一，也是保證實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)質(zhì)量的重要手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制十分重要。