應用拉曼光譜技術開展乳制品安全快檢的探討

陳 泳，林子旭，宋 歡，花 錦*

（1.漳州海關綜合技術服務中心，福建漳州 363005；2.太原海關技術中心，山西太原 030024）

乳制品指的是使用牛乳或羊乳及其加工制品為主要原料，加入或不加入適量的維生素、礦物質和其他輔料，使用法律法規及標準規定所要求的條件，加工制作的產品[1-2]。乳制品的質量與安全是一個全球性的重要食品問題，許多國家紛紛采取立法、行政、司法以及檢驗監督等措施，保障乳制品的質量與安全[3]。就理化安全指標而言，乳制品長期面臨著以下幾方面風險的挑戰。

①乳制品原料、半成品或成品的摻偽和假冒行為。如在高價值的羊乳粉中摻入價值較低的牛乳粉，在高端品牌乳粉中摻入廉價品牌的乳粉，冒充乳粉原產地造假等。②乳制品的藥物殘留問題。一方面，產乳牲畜在成長期、哺乳期食用了受到農藥污染的牧草和飼料，另一方面，牧民為維持牲畜健康使用了殺蟲劑和抗生素，這些農藥和獸藥的殘留物或代謝產物可能會伴隨生乳帶入乳制品[4]。③乳制品的污染物問題。產乳牲畜在放牧和飲水過程中對環境污染物的攝食，加工設備在生產過程中使用的化學消毒試劑，以及加工環境都可能使乳制品帶入或產生污染物，從而危害人體健康[5]。④食品添加劑的超限量使用。食品添加劑可以改善乳制品的色澤、風味、外觀和口感，方便加工和儲存，但超限量使用食品添加劑一定程度上會影響人體健康，因此，要按照國家標準的規定嚴格控制食品添加劑用量[6]。⑤非法添加物。最為典型的案例是2008年的毒奶粉事件。2008年，中國三鹿等公司銷售含添加了三聚氰胺的牛乳和嬰兒配方乳粉，導致腎結石和腎功能衰竭的患病人群近30萬，其中6名嬰兒死亡[7]。三聚氰胺并非食品添加劑，而是用來掩蔽乳制品中蛋白質含量不足的非法添加物，這些添加物因對人體的危害重大，嚴禁添加在食品中。

鑒于乳制品已成為大眾化的重要食品，它的質量安全備受監管部門和消費者關注，乳制品安全指標的檢測手段也日益豐富。2010年起至今，我國已先后頒布乳制品檢測方法標準49項，其中理化檢驗方法39項，主要涉及污染物、農獸藥殘留、營養成分及一些禁止添加或限量添加的指標。我國已經基本建立起了較為完善的乳制品檢測方法標準體系，然而，這些標準方法多為實驗室方法，檢測成本高、周期長，甚至有超出產品保質期的風險。對于進口乳制品而言，實驗室檢測周期長會嚴重影響通關速度，因此海關系統急需建立一套針對乳制品的安全指標快速檢測技術（下文簡稱“快檢”）[8]。快檢是一種快速定性或定量的檢測技術，該技術具有設備易于攜帶、耗時短、操作方便等優點，特別適用于一線現場監管。目前常用的快檢技術主要有酶抑制法、化學比色法、生物芯片法、膠體金免疫層析法、拉曼光譜法、生物化學發光法和生物傳感器法等[9]。近年來，拉曼光譜技術在食品檢測的應用成為新熱點，便攜式拉曼光譜儀攜帶方便，操作簡單，檢測速度快，因此有很大的現場執法應用潛力。目前，關于拉曼技術在乳制品快檢領域的應用研究較多，本文在參考國內外相關研究文獻報道的基礎上，結合海關總署科研項目“拉曼光譜技術在進口乳粉摻假快速鑒定中應用研究”（2019HK120）的研究結果，對拉曼快檢技術在乳制品快檢方面的應用前景做總結分析。

1 摻偽或冒牌產品的鑒別

在乳制品中，乳粉（包括嬰幼兒配方乳粉）是貨值最高的產品，也是最容易被仿冒的，對進口乳粉而言，最常見的是原產地造假[10-12]。有研究表明，相比國產品牌，消費者對歐盟品牌有最高的購買意愿，新西蘭品牌次之，因此原產歐洲和新西蘭的乳粉更可能被其他產地乳粉冒充[13]。針對乳粉的品牌冒充或摻偽現象，近年來已有應用SERS技術進行鑒別的研究。由于乳粉是一種成分相當復雜且非完全均勻的固體粉末，單純分析各個品牌乳粉的拉曼光譜信號，會發現不同品牌乳粉的拉曼特征峰并無顯著差異，只有局部或細微差異。這些差異源于蛋白質、脂肪和碳水化合物的含量差異，因為這種差異不夠顯著，需要借助化學計量學的方法對拉曼光譜信息進行處理分析，才能最終進行判別[14]。

張正勇等[15]將乳粉置于多孔芯片平臺，用便攜式拉曼光譜儀直接掃描樣品采集信號，再對樣品的光譜信號值進行相關系數計算，比較同一品牌乳粉內部以及5個品牌乳粉間的相似度差異，并構建質量波動控制圖。結果顯示同一品牌乳粉內部拉曼光譜信號相似度高（在0.999 2～0.999 7范圍內波動），而不同品牌乳粉間拉曼光譜信號相似度較低（在0.950～0.995范圍內波動），據此結合質量波動控制圖，可初步實現不同品牌乳粉的鑒別。該研究的方法雖然簡便快捷，但研究中用作比對的A品牌在做內部比較時并沒有提及這些樣品是否為同一罐、同一批次乳粉，或者是不同批次乳粉，因此不能排除不同生產日期、不同批次產品之間相似度大幅波動的可能。為進一步驗證該方法的適用性，本研究采集了6種品牌的乳粉，每種品牌采集3個不同生產日期樣本，同一品牌乳粉的生產日期間隔3個月，運用張正勇等的方法對6種品牌乳粉進行鑒別。

結果如表1所示，為避免爭議，品牌以字母代替。①品牌內部考察。品牌B、C、E的相關系數值均在0.99以上，波動區間均在0.000 8以內；品牌A、D、F的相關系數值最低的甚至低于0.90，最高的也在0.99以下，波動區間分別為0.047 2、0.067 9和0.012 7。②品牌間考察。各品牌任選一個生產日期的批次與A品牌的信號均值進行相關系數計算，結果在0.929 8～0.974 6范圍內波動，這與A品牌內部系數相比，并沒有顯著差異，甚至E品牌與A品牌的相關系數值超過了A品牌內部的所有相關系數值。這表明不同品牌乳粉的產品穩定性差異很大，有些品牌很穩定，有些品牌不同生產日期間差異較為顯著，因此無法斷定不同品牌間相關系數值的差異度究竟是來源于品牌間差異還是來源于品牌本身原料和生產過程的穩定性差異，運用全譜數據結合相關系數運算難以真正有效鑒別乳粉品牌。

表1 品牌內與品牌間相關系數值差異比較

王海燕等[14]將兩種乳粉按不同比例混合成5種摻偽乳粉，提取摻偽乳粉中的脂肪，采集脂肪樣本的拉曼光譜特征峰值，結合主成分分析（Kernel Principal Component Analysis，KPCA）運算和最近鄰算法（Nearest Neighbor，NN）模型對5種脂肪樣本進行識別，10次交叉驗證下的平均識別率達到98.89%，平均運算時間只有0.104 s。該研究采用的樣本數量充分，每個品牌乳粉采集了10個，生產日期區間為7個月，同時考慮到樣品的均勻性對拉曼譜圖重復性的影響，采用液液萃取法提取摻假乳粉中的脂肪作為摻假乳粉的供試品，并且運用了KPCA方法對采集的數據進行了可視化描述，運用NN模型開展交叉驗證實驗，論證充分，為乳粉的摻偽鑒別應用指明了前景。然而，該研究方法需要對樣品的脂肪進行提取，提取過程需要在實驗室條件下開展，全流程至少需要12 h，顯然還不適用于現場監管的快檢。

2 藥物殘留的檢測

隨著農藥殘留和獸藥殘留問題受到社會的普遍關注，拉曼技術在藥物殘留檢測領域的應用研究也比較多，然而聚焦乳制品的研究并不多，主要的研究方向是牛乳中的獸藥殘留。有相關研究報道的獸藥有氨芐青霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素和磺胺吡啶[16-19]。此外，本文研究對牛乳中的恩諾沙星、達氟沙星以及慶大霉素的拉曼快檢技術可行性進行了評估。表2根據方法的檢測限以及《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）對現階段文獻及本文研究的獸藥殘留拉曼快檢可行性做出了簡單評估。從表2可知，目前利用拉曼快檢技術檢測牛乳能有效檢出的獸藥還非常有限，這可能是因為牛乳的基體比較復雜，獸藥殘留分子在牛乳基體中的拉曼信號普遍較低。要提高藥物殘留分子的拉曼信號必須采用表面增強拉曼光譜（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，下文簡稱“SERS”）技術，同時對金屬納米檢測探針和SERS基底材料進行優化。SERS技術表現出很高的專屬特異性，即需要針對不同類型的分子設計出不同的納米探針和基底[20]，這和目前一些已經市場化的快檢技術有所不同。目前市場流行的快檢方法如酶抑制率法和膠體金法，可以很快地檢出樣品是否含某類藥殘，如四環素類和喹諾酮類等，但在檢出具體項目上，如四環素和恩諾沙星，SERS技術因其專屬特異性，具有更大優勢。

表2 牛乳中獸藥殘留拉曼快檢技術可行性評估

3 污染物的檢測

乳制品主要存在的污染物有汞、鎘、砷、鉛、鉻等重金屬離子以及亞硝酸鹽、硝酸鹽、苯并芘等。常規的SERS技術在重金屬離子檢測中存在選擇性差、檢出限高、檢測范圍窄的問題，以貴金屬納米粒子及粗糙表面組成的SERS活性基底的制備成為應用SERS技術高效檢測重金屬離子的關鍵[21]。據梁營芳等[22]總結主要的重金屬離子幾乎都找到了合適的專屬SERS基底，應用該技術在水中的檢測限最低達到1.7×10-10mg/mL，最高1×10-4mg/mL，遠低于《食品安全國家標準 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中對各類食品的限量要求。梁營芳報道水中重金屬的檢測案例，這些方法在乳制品中的靈敏度是否會因乳制品復雜的基體而大打折扣，還有待進一步的研究驗證。對于部分沒有拉曼信號或拉曼信號很弱的物質，如亞硝酸根，需要對其進行衍生化，轉化為具有拉曼信號的物質后再用SERS進行檢測[23]。陳泳等[5]建立了衍生化-富集-表面增強拉曼光譜法，快速檢測乳粉中亞硝酸鹽，根據不同批次處理量發現單個樣品檢測全過程只需3～15 min，定性檢測限為0.4 mg/kg，遠低于國家安全標準對亞硝酸鹽的限量要求（2 mg/kg），證明利用拉曼快檢手段檢測乳粉中亞硝酸鹽完全可行。苯并芘作為強致癌物質，是油脂質量的一個重要檢測指標，國家標準限定油脂及其制品（含乳制品的乳油）含量不得超過10 μg/kg，錢立[24]用膠體金作為基底，并優化油脂中苯并芘的快速檢測的前處理方法，所建立的方法檢測限可達5 μg/L，線性范圍在0～100 μg/L，相關線性系數可達0.99，驗證了苯并芘利用拉曼快檢手段的可行性。總體看來，利用拉曼技術實現乳制品主要污染物的快檢可行性較強。

4 食品添加劑檢測

食品添加劑是為改善食品品質和色香味以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或天然物質。不同于違禁添加物，食品添加劑可以在允許的限量范圍內使用。根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定，不同的食品細類允許的添加劑最大使用量各不相同，如阿斯巴甜在乳制品中的最大使用量分為調制乳、風味發酵乳、調制乳粉和調制乳油粉、稀乳油和干酪等多個細類，每個細類的規定用量并不相同，這對定量檢測提出了挑戰。

目前，拉曼快檢的成熟應用場景多數還停留在定性檢測上，在實際定量分析過程中，仍存在再現性欠佳、信號易受實驗測試條件和基底干擾等因素的影響，其定量分析技術仍亟待提高和完善[25]。目前，關于乳制品中食品添加劑的拉曼快檢應用鮮有報道，宣芳等[26]對SERS技術在食品添加劑檢測方面的應用進展做出了系統性的總結和概況，文中報道的研究無一涉及乳制品，研究實例中提到的技術指標也多數限于討論檢出限。該文也指出了拉曼快檢技術在添加劑領域的應用還需要提升的幾個方面[26]：①優化活性基底，實現標準化和商業化；②探討如何去除或減少熒光效應；③提升方法的穩定性和重現性。由此可見，將拉曼快檢推廣到乳制品的添加劑領域，需要先跨越拉曼快檢技術本身定量還不夠成熟穩定的技術屏障。

5 非法添加物檢測

對非法添加物而言，檢測方法只需要滿足檢出限低于相關法規規定的限量值，即可實現應用前提。如三聚氰胺在嬰兒配方食品中的限量規定為1 mg/kg，若拉曼快檢方法的檢出限能穩定低于1 mg/kg，就有一定的可行性。鑒于三聚氰胺事件的深遠影響力，該項目的拉曼快檢研究在我國得以高度的聚焦，研究人員嘗試從前處理技術、納米探針、SERS基底等多個方面進行方法改進，不斷提高靈敏度。DONG等[27]用適體修飾的SERS納米傳感器和寡核苷酸芯片建立的納米探針檢測牛乳中的三聚氰胺，檢測限達到了1 pg/mL。王琳等[28]用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金溶液作為SERS的增強試劑，檢測限為1 μg/mL，樣品前處理與檢測時間一共只需15 min，可以采用手持式或便攜式拉曼光譜儀，非常適合現場快檢。相比之下，王琳的方法不僅僅檢測限遠低于限量規定，材料制作成本低于DONG的方法，檢測快速，甚至可以采用手持式拉曼檢測，顯然比DONG的方法更有應用前景。乳粉由于基體成分的復雜，需要先使用固相萃取方法對目標物進行凈化和富集，再進行SERS檢測。雷皓宇等[29]使用三氯乙酸提取乳粉中三聚氰胺，用中性氧化鋁進行分散固相萃取后上機檢測，檢出限為0.075 mg/kg，回收率為79.5%～124.0%，RSD小于8.8%，檢測時間約20 min。黃鵬程[7]采用三氯乙酸提取，陽離子固相萃取柱凈化及富集的方法檢測嬰兒配方乳粉中三聚氰胺，檢測限為0.1 mg/kg，回收率為96.1%～103.6%，RSD小于7%，檢測時間約20 min。相比之下，雷皓宇方法檢出限略低于黃鵬程方法，后者在回收率和RSD指標略有優勢，但固相萃取的成本和操作難度高于分散固相萃取，綜合評價，雷皓宇的方法更為推薦。

近年來，乳制品中的硫氰酸根問題也逐漸成為監管的關注點。國際食品法典委員會（CAC）允許硫氰酸鈉在生乳中作為防腐劑，規定添加量為14 mg/kg。2008年，我國政府明令禁止將硫氰酸鹽作為牛乳或其他食品的添加劑[30]，由于乳品中存在本底值，將液態乳品中硫氰酸鈉的風險監測參考值確定為10 mg/kg。陳小曼等[30]采用三氯乙酸提取目標物，C18硅膠凈化后使用便攜式拉曼上機，檢出限為7.5 mg/kg，回收率在70.5%～109%，RSD小于9.8%，檢測時間約15 min，方法簡便快捷，有較好的應用前景。

6 結語

食品安全快檢技術作為政府部門開展監督抽檢和風險監測的檢測手段之一，其檢測結論目前并不允許作為執法依據，快檢手段檢出的不合格樣品或陽性樣品，必須采用實驗室標準方法進行確認。快檢技術的真正優勢體現在可移動、易操作、耗時短和定性準確幾個方面，因此，將拉曼技術應用于乳制品快檢，這幾個方面應成為主要的考量因素。綜合上文分析，本文做出如下總結。①在乳制品摻偽鑒別方面，拉曼技術通過結合化學計量運算和交叉驗證方法對于乳粉的原產地（品牌）鑒別具有一定的應用前景，但仍需解決前處理繁雜耗時的問題，而對于不同動物源的奶粉摻偽鑒別，相比生物化學方法，沒有優勢。②在藥物殘留方面，拉曼快檢技術的應用開發應揚長避短，發揮拉曼探針和基底多樣性的特點，將研究方向瞄準安全問題突出，而其他快檢技術還難以攻克的項目。③在污染物方面，SERS技術有著比較好的應用前景，尤其是重金屬類，在檢測水質方面表現出極高的靈敏度，應開展更多研究論證SERS技術在開展乳制品中重金屬快檢的可行性。④在食品添加劑方面，可以嘗試先在規定限量一致的項目進行突破，比如乳制品中的一些人工合成著色劑（日落黃、檸檬黃、亮藍等），對于細類規定限量不一致的項目，還需先解決定量精確度和重現性的問題。⑤在非法添加物方面，將拉曼技術應用于三聚氰胺和硫氰酸鈉快檢具備可行性，還需要改進的問題是如何選用更經濟的材料、耗材以及提高檢測時效。綜上所述，拉曼光譜，尤其是SERS技術的突出優勢在于專屬特異性強，短板在于納米探針和基底的多樣性導致的開發和制作成本較高，應綜合考慮實際應用需求、經濟成本以及可實操性多個維度，把握好研究方向。