沉默lncRNA TPT1-AS1對非小細胞肺癌生物學行為的影響及機制研究

惠珂 霍樹芬 劉凌華 王君 田應選

非小細胞肺癌已經成為目前嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，目前缺乏早期的診斷和有效的治療手段干預，導致大部分患者預后處于較差的水平[1]。近年來所興起的非編碼RNA為臨床上非小細胞肺癌的研究提供了新的方向，長鏈非編碼RNA(LncRNA)屬于非編碼RNA中的一類，參與機體多種生理病理過程。TPT1-AS1是近年來最新發現的一種位于13號染色體上的LncRNA，已有研究顯示，TPT1-AS1參與惡性腫瘤的發生發展[2]。目前臨床上對于LncRNA TPT1-AS1與非小細胞肺癌的關系研究較少，僅有賀伯偉等[3]研究中認為其在非小細胞肺癌中高表達。基于上述研究，在本文中分析長鏈非編碼RNA(lncRNA)TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中的表達及對沉默lncRNA TPT1-AS1非小細胞肺癌生物學行為的影響及機制，為臨床上非小細胞肺癌的診治提供新方向。

資料與方法

一、 材料

研究組織：取我院病理科留存的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，做lncRNA TPT1-AS1指標檢測。

研究細胞：人非小細胞肺癌A549細胞株購自武漢純度生物科技有限公司，貨號CD-4742-SB。本文研究通過我院倫理委員會批準。

主要試劑：TPT1-AS1過表達轉染質粒(si-TPT1-AS1-NC)、TPT1-AS1沉默(si-TPT1-AS1)轉染質粒，由上海吉瑪公司設計并合成；

兔抗大鼠PTEN抗體購自南京北魚生物科技有限公司；兔抗人MMP-2抗體、兔抗人MMP-9抗體購自艾美捷科技有限公司；兔抗大鼠p-PI3K抗體購自艾美捷科技有限公司；兔抗人p-AKT抗體購自深圳欣博盛生物科技有限公司；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司。

二、 方法

1 lncRNA TPT1-AS1檢測 取所制備的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，一部分做切片采用免疫組化檢測lncRNA TPT1-AS1表達情況，一部分在冰箱中保存采用實時熒光定量PCR法檢測lncRNA TPT1-AS1 mRNA表達情況。

免疫組化：將所制備的非小細胞肺癌組織和癌旁組織做石蠟切片做脫蠟處理，在乙醇中浸泡5 min后使用無菌蒸餾水洗滌，將檸檬酸鈉抗原修復液加入至沸水中，做水浴處理，水浴處理20 min后冷卻，在其冷卻至室溫后使用PBS做反復清洗處理，反復清洗3次，每次清洗時間為5 min，之后將1:200比例的lncRNA TPT1-AS1抗體滴入后放置于溫度為4℃濕盒中保存，過夜，隔日復溫，使用PBS反復清洗3次，之后將1:50比例的二氨基聯苯胺加入做顯色處理，加入蒸餾水終止反應。之后使用蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯沖洗至透明，最后封片、顯微鏡觀察。依據染色細胞百分比和染色程度評估陽性情況，-為陽性細胞數<10%，+為10%≤陽性細胞數≤25%，++為25%<陽性細胞數≤75%，+++為為75%<陽性細胞數。

實時熒光定量PCR法：取在冰箱中保存的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，采用Trizol法提取組織中總RNA，提取完成后測定所提取的RNA純度和含量，Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄獲得cDNA，使用RT-PCR方法檢測lncRNA TPT1-AS1 mRNA表達量，采用2-△△Ct方法計算。反應體系：上下游引物0.4 μl、cDNA模板1 μl、SYB Green 10 μl，加蒸餾水至20 μl。反應條件：95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 31s，共進行40個循環。lncRNA TPT1-AS1引物序列：上游：5’-GCTATCCTTGCCCATCTTCCTA-3′，下游：5′-GAGGCCAGTGCTCTGAAGGAAA-3′；內參基因GAPDH引物序列：上游：5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，下游：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

2 細胞培養及lncRNA TPT1-AS1轉染 將人非小細胞肺癌A549細胞株使用含10%胎牛血清、雙抗的RPMI 1640完全培養基在溫度為37℃、5% CO2、飽和濕度環境下培養，每3d更換1次新鮮培養液，待細胞融合度在70%～80%時，行傳代培養。取對數生長期的人非小細胞肺癌A549細胞，將細胞分為空白組、過表達組、沉默組。使用GenBank查找序列獲得TPT1-AS1序列，構建TPT1-AS1過表達轉染質粒(si-TPT1-AS1-NC)、TPT1-AS1沉默(si-TPT1-AS1)轉染質粒，由上海吉瑪公司設計并合成，參照Lipofectamine 2000說明書行轉染操作，過表達組轉染si-TPT1-AS1-NC質粒，沉默組轉染si-TPT1-AS1質粒，轉染24h后做后續試驗，空白組細胞不做任何處理。si-TPT1-AS1-NC序列：5′-CCTATCTGCTAAACATGTATC-3′；si-TPT1-AS1序列：5′-GGCCCTCAATTTTCAATGCATT-3′。

3 轉染效率鑒定 在轉染24h后采用實時熒光定量PCR法測定lncRNA TPT1-AS1轉染效率，方法同1.2.1中實時熒光定量PCR法。

4 細胞增殖檢測 細胞增殖情況使用MTT比色法測定，將所測定的細胞濃度進行調整，調整濃度為3×104個/mL，上述操作完成后將所測定的細胞在96孔板中接種，每孔中加入200 μL的細胞懸液培養24、48、72 h后(培養環境為37℃、5% CO2)將10 μL MTT試劑加入，孵育4 h，使用酶標儀測定OD值，計算增殖率。細胞增殖率=(檢測的細胞組OD值/對照組OD值)×100%。

5 細胞凋亡檢測 細胞凋亡情況使用TUNEL法測定，將所培養的細胞做洗滌、DAPI染色封片后的細胞核分別呈現為藍色熒光、綠色熒光，其中藍色熒光表示陰性細胞數，綠色熒光表示陽性細胞數，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。

6 細胞遷移檢測 細胞遷移能力使用劃痕實驗測定，將所培養的細胞在18孔板上進行接種，待細胞生長至80%時，使用槍頭(100 μl)做垂直劃直線操作，之后使用PBS洗滌3次，加入血清培養基(0.5 %)，24 h后使用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況。

7 細胞侵襲檢測 細胞侵襲能力使用Transwell小室測定，Transwell小室中放置所培養的細胞，其中下室接種100 ng/mL IL-8、上室接種細胞懸液，1 d后下室加TMP溶液TMP溶液孵育，孵育時間大約為180 min，之后使用潔凈無菌棉簽將上室微孔中的細胞擦除，PBS洗滌，洗滌操作完成后在4%多聚甲醛溶液中固定15min，蘇木晶染色、PBS清晰，使用倒置顯微鏡觀察細胞侵襲情況。

8 細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白檢測 細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達情況使用Western Blot法測定，對所培養的細胞做離心、蛋白提取，提取完成后使用BCA做蛋白定量測定，將所提取的50 μg蛋白加入至2×SDS凝膠緩沖液中，做電泳、轉膜、取膜、固定、封閉處理，將1:1000比例的TBST稀釋的PTEN、p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax一抗，在溫度為4℃的環境下孵育過夜，TBST重復做3次洗膜處理，加入1:10000 TBST稀釋的二抗，搖動孵育60 min，TBST重復做3次洗膜處理，使用DAB做顯色處理，分析蛋白表達情況。

三、 統計學處理

結 果

一、 非小細胞肺癌組織、癌旁組織中lncRNA TPT1-AS1表達情況對比

如(表1、圖1)所示，與癌旁組織相比，癌組織TPT1-AS1 mRNA表達量升高(P<0.05)。

表1 非小細胞肺癌組織、癌旁組織中lncRNA TPT1-AS1表達情況對比

圖1 TPT1-AS1免疫組化圖(SP×400，比例尺：100μm)

二、 lncRNA TPT1-AS1轉染效率

如(表2)所示，與空白組相比，過表達組TPT1-AS1 mRNA表達量升高，沉默組TPT1-AS1 mRNA表達量降低(P<0.05)，說明轉染成功。

表2 lncRNA TPT1-AS1轉染效率

三、 各組細胞增殖、凋亡情況對比

如(表3、圖2)所示，與空白組相比，過表達組各時間點細胞增殖率升高，凋亡率降低(P<0.05)；與空白組相比，沉默組各時間點細胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組各時間點細胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.05)。

圖2 細胞凋亡TUNEL圖(×10)

表3 各組細胞增殖、凋亡情況對比

四、 各組細胞遷移、侵襲情況對比

如(表4、圖3、4)所示，與空白組相比，過表達組細胞遷移數、侵襲數升高(P<0.05)；與空白組相比，沉默組細胞遷移數、侵襲數降低(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組細胞遷移數、侵襲數降低(P<0.05)。

圖3 細胞遷移圖(×100)

圖4 細胞侵襲圖(×100)

表4 各組細胞遷移、侵襲情況對比 個]

五、 各組細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達量對比

如(表5、圖5)所示，與空白組相比，過表達組PTEN、Bax蛋白表達量降低，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量升高(P<0.05)；與空白組相比，沉默組PTEN、Bax蛋白表達量升高，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組PTEN、Bax蛋白表達量升高，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)。

圖5 蛋白WB圖

表5 各組細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達量對比

討 論

肺癌已經成為全世界范圍內發病率、死亡率均較高的惡性腫瘤之一，肺癌類型中主要以非小細胞肺癌最為常見，非小細胞肺癌的發生不僅在一定程度上影響患者生活質量，而且隨著疾病的進展威脅患者的生命安全[4-5]。目前臨床上認為非小細胞肺癌的發生與多種因素共同作用相關，但其具體作用機制尚不明確，且目前所應用的治療手段并不能達到理想的效果，因此積極尋找診斷和治療此病的靶點，對改善患者預后具有重要的意義。

隨著目前臨床上對lncRNA的逐漸深入研究發現，其可在一定程度上影響癌細胞增殖、遷移、侵襲，lncRNA TPT1-AS1屬于lncRNA的一種，首先在2016年被Wang等[6]研究在腦膠質瘤中發現，其研究顯示，TPT1-AS1在Ⅲ型間變性腦膠質瘤低風險組中高表達，與患者預后相關。之后相繼有研究發現，lncRNA TPT1-AS1的表達與宮頸癌[7]、上皮性卵巢癌[8]、大腸癌[9]、前列腺癌[10]相關。目前關于lncRNA TPT1-AS1與非小細胞肺癌關系的研究較少，僅有賀伯偉等[3]在2020年的最新研究中認為lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中高表達。在本文研究中，分析lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中的表達，結果發現，與癌旁組織相比，lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中高表達，與上述研究結果保持一致。基于上述研究背景，在本文中做lncRNA TPT1-AS1沉默處理，分析沉默lncRNA TPT1-AS1后對非小細胞肺癌細胞生物學行為的影響，結果發現，沉默lncRNA TPT1-AS1非小細胞肺癌細胞異常增殖、遷移、侵襲現象明顯被抑制，凋亡率明顯增加，此結果提示著，lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌中高表達，沉默后可明顯改變異常的癌細胞生物學行為，其可能參與非小細胞肺癌的發生進展。

在非小細胞肺癌發生轉移的過程中會分泌大量的MMP-2、MMP-9等金屬蛋白酶家族蛋白，當MMP-2、MMP-9含量過高后會降低癌細胞與細胞外基質的黏附作用，降解基底膠原纖維，進而增強癌細胞的侵襲、遷移力，使其進入至血液系統或者淋巴系統中，最終在肺外形成新的轉移病灶[11-12]。另外細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡為機體在維持機體內環境穩定時所產生的一種細胞自主且有序的死亡過程，而當細胞發生癌變后其凋亡明顯被抑制，表現為Bax、Bcl-2等細胞凋亡蛋白失衡[13-14]。本文結果顯示，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，上述指標表達異常現象明顯被改變，此結果提示著，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制非小細胞肺癌轉移。目前隨著臨床上對非小細胞肺癌的逐漸深入研究發現，PTEN突變缺失、PI3K的異常活化參與肺癌細胞的增殖和遷移等過程，在此過程中具有重要的意義[15-16]。PTEN-PI3K-AKT信號通路參與癌細胞的增殖、遷移等異常生物學行為，在機體處于正常狀態下時，PTEN與PI3K之間處于動態平衡，在細胞正常增殖、功能的穩定中發揮作用，但在細胞癌變后PTEN會經抑制PI3K表達而發揮其抑制癌細胞異常增殖、遷移的作用，最終抑制疾病進一步惡化[17-18]。另外有研究顯示，激活的AKT可促進癌細胞增殖、遷移，而PTEN可對AKT產生負向調控作用，降低其AKT磷酸化含量，使其失活，發揮其抑制癌細胞增殖、遷移的作用[19-21]。本文中擬認為沉默lncRNA TPT1-AS1抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡的機制為調控PTEN-PI3K-AKT信號通路，并進一步驗證，結果顯示，沉默lncRNA TPT1-AS1后，PTEN表達增加，PI3K、AKT表達降低，此結果提示著，沉默lncRNA TPT1-AS1可能經維持PTEN與PI3K之間平衡和負向調控AKT而改變MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2表達，最終發揮其阻礙疾病惡化的作用。

綜上所述，本文研究發現非小細胞肺癌組織中lncRNA TPT1-AS1高表達，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，其機制可能與調控PTEN-PI3K-AKT信號通路相關，經調控Bax、Bcl-2表達抑制細胞增殖，促進凋亡，經調控MMP-2、MMP-9表達抑制細胞遷移、侵襲。