基于毒痰瘀虛理論的中藥復方對肝癌小鼠腫瘤組織的抑制作用*

黃海堂 吳輝坤 皇甫炎林 潘 誼

1.湖北中醫藥大學 (湖北 武漢， 430061) 2.湖北省中醫藥研究院，湖北省中醫院

湖北省中醫院肝病研究所在20余年的臨床實踐與科學研究中，形成了獨特的肝癌治療思路，即從“毒痰瘀虛”四大證候要素進行臨床辨證論治。前期研究表明，根據肝癌“毒痰瘀虛”的證候要素特點，采用扶正解毒化痰祛瘀法治療肝癌患者可有效改善癥狀，具有明顯的臨床效果。通過對前期肝病門診原發性肝癌患者的處方藥物進行數據挖掘[1]，綜合吳壽善等全國名老中醫治療肝癌的用藥特點，課題組總結出了治療肝癌的31味高頻中藥。本課題對此31味中藥進行了CCK-8篩選，初步形成了針對證候要素“毒、痰、瘀、虛”的中藥復方毒痰瘀脾腎虛方，即毒痰瘀全方。為了闡明肝癌毒痰瘀虛四大證候要素的科學性及其本質，我們根據毒痰瘀脾腎虛方組方的證候要素特點進行拆方、組方，分別形成了全方、脾虛方、腎虛方、腎陽虛方、腎陰虛方，毒痰瘀方6大組方，并通過小鼠試驗，探討中藥復方及其拆方組方對肝癌荷瘤小鼠瘤體的影響，比較全方與拆方組方間的作用差異，分析基于毒痰瘀虛理論的中藥復方抗肝癌的作用效果與機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和細胞 雄性昆明小鼠40只，體重 (20±2)g，購自武漢大學實驗動物中心；H22肝癌細胞株購至武漢大學動物實驗中心。

1.2 藥物組成 毒痰瘀方：葉下珠、旋覆花、皂角刺各10 g，半枝蓮、白花蛇舌草各15 g，天葵子、丹參、姜黃各20 g，黨參30 g。腎虛方：毒痰瘀方加干地黃、續斷、沙苑子各20 g。腎陽虛方：毒痰瘀方加續斷、沙苑子各20 g。腎陰虛方：毒痰瘀方加干地黃20 g。脾虛方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術各30 g。全方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術各30 g，干地黃、續斷、沙苑子各20 g。索拉非尼(200 mg/粒)購自德國拜耳制藥公司。

1.3 制劑方法 所用中藥購自我院藥劑科，由我院藥劑科分別加工成生藥含量為 2 g/ml 的復方藥劑。計算藥物總克數，加10倍蒸餾水，倒入鍋中煎煮1 h后用紗布過濾出濾液待用；藥渣加10倍蒸餾水再煎1次，過濾；丟掉藥渣，把兩次得到的濾液倒入鍋內加熱濃縮，使藥液濃度濃縮至2 g/ml，裝瓶，放入冰箱備用。濃度計算方法:濃度=復方總克數(g)/濃縮液體積(ml)。

1.4 試驗器材 脫水機、組織攤烤片機購于武漢俊杰公司，病理切片機購于德國Leica RM公司，載玻片及蓋玻片購于江蘇世泰實驗器材有限公司，抗原修復用電陶爐購于SKG，BX53型生物顯微鏡購于奧林巴斯，微量移液器購于Eppendorf，電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉儀購自北京六一儀器廠，水平搖床購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，pH計購自德國Metter-Toledo GmbH公司，磁力攪拌器購自金壇市中大儀器廠，酶標儀購自Thermo，離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.5 主要試劑 無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹膠購于國藥集團，蘇木素購于Sigma，Dako REAL EnVision Detection System購于安捷倫(Dako)，磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺購自Amresco，Trise-Base、二硫叔糖醇(DTT)、Trise-Base、Tris-base購自Biosharp，蛋白marker(10-250 KD)購自fermentas，小鼠單抗β-actin 、HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗p-GSK3β(46 KD)購自AFFINITY，余檢測抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司，X光膠片購自柯達，顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠，WB檢測其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.6 方法

1.6.1 動物分組 雄性昆明小鼠40只隨機分為8組，A組為空白組，B組為索拉菲尼組，C組為全方組，D組為脾虛組，E組為腎虛組，F組為腎陽虛組，G組為腎陰虛組，H組為毒痰瘀組，每組5只小鼠。

1.6.2 造模與處理 ①常規方法復蘇小鼠H22肝癌細胞,在1640培養基中培養2～3 d；②用無菌生理鹽水調整細胞濃度為(2～3)×106個/ml,取0.2 ml注入小鼠腹腔內,待 7～10 d后,抽取腹水，按上述方法進行傳代2次；③無菌操作取上述H22小鼠腹水,用無菌生理鹽水稀釋,臺盼藍染色瘤細胞計數,活瘤細胞>90%,調整瘤細胞濃度為1×107個/ml,取0.2 ml接種到小鼠右腋皮下。④待小鼠普遍出瘤至直徑約1 cm時開始灌胃給藥，1次/d，連續給藥2周。A組小鼠不給于任何藥物，B組小鼠給予索拉非尼4 μmol/g灌胃，C、D、E、F、G、H各組小鼠按照2 ml/100 g 體重給予相應的中藥濃縮液灌胃。均以標準飼料和正常飲水進行喂養。自給藥開始之日起，在第20 d時使用頸椎脫臼法處死所有小鼠，分離腫瘤組織，稱重，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(空白組平均瘤重-藥物組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。

1.6.3 免疫組化法分析瘤體微血管密度及Western blot檢測 腫瘤組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白表達。按照常規方法操作。

2 結果

2.1 各組小鼠抑瘤率比較 見表1。

表1 不同藥物對小鼠瘤體抑瘤率比較

2.2 不同藥物處理對瘤體微血管密度的影響 見表2。

表2 不同藥物處理對MVD的影響

2.3 各組小鼠腫瘤組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達 見圖1、2。

圖1 不同組瘤體組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達

圖2 不同組瘤體組織中p-GSK3β、β-catenin蛋白的表達

3 討論

本研究發現，毒痰瘀全方及其拆方組方皆可顯著抑制小鼠瘤體的生長，降低腫瘤組織MVD表達，抑制肝癌組織中血管的生成。微血管形成是腫瘤侵襲、轉移能力提高的主要原因，在腫瘤的惡性生物學行為中起到至關重要的作用，而MVD是反映血管形成的關鍵指標[2]。毒痰瘀全方及脾虛方、腎虛方、腎陽虛方、腎陰虛方在毒痰瘀方的基礎上按其不同證候分型加入了黃芪、白術、干地黃、續斷、沙苑子補脾益腎藥物，對MVD的抑制效果皆明顯優于毒痰瘀方。研究發現[3]，黃芪低分子量多糖無法直接殺傷癌細胞，通過刺激機體免疫，提高淋巴細胞增殖率等，增強機體的各項免疫能力，進而發揮抗腫瘤的作用；沙苑子具有一定程度的抗癌、抗突變及提高機體特異性免疫與非特異性免疫功能[4]。臨床研究中，白術多糖作為白術的主要成分，對小鼠具有良好的免疫增強作用，可有效促進淋巴細胞的轉化功能，有效降低腫瘤細胞增殖率[5]，干地黃、續斷在增強機體免疫方面亦具有較好的效果[6，7]。免疫過程在肝癌的發生發展中發揮著重要的抑制作用，由此我們推測黃芪、白術、干地黃、續斷、沙苑子在抗腫瘤功效方面可能與解毒、化痰、祛瘀類藥物發揮著協同作用。

由Western blot檢測結果可以發現，全方及其拆方組方皆可明顯抑制β-catenin蛋白的表達。全方對蛋白抑制效果接近索拉菲尼，優于其拆方組方，而毒痰瘀方劣于全方及其他拆方組方。全方對β-catenin蛋白的抑制作用與毒痰瘀腎虛方無明顯差異，皆優于其他拆方組方。糖原合酶激酶3β(GSK3β)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，有高達上百種的底物并為多條信號通路樞紐，在細胞活動中發揮著非常重要的功能，與細胞分裂和凋亡、糖原代謝、生長代謝、神經信號傳遞、腫瘤發生等均密切相關。GSK3β作為Akt的底物，能夠被Akt直接磷酸化而失活，引起轉導通路的級聯反應，從而發揮促細胞生存和抗凋亡等作用[8，9]。β-catenin是典型Wnt信號通路的核心成分，其核積累是Wnt信號靶基因轉錄激活所必需的，β-catenin蛋白可以調節Wnt下游幾個靶基因的轉錄，如cyclinD1、cmyc等，促進細胞的轉移和侵襲[10]。β-catenin在人肝癌腫瘤標本和肝癌干細胞中強烈表達，并導致肝癌患者預后不良[11]。

綜上所述，基于毒痰瘀脾腎虛方及其拆方組方皆可明顯抑制肝癌小鼠瘤體及微血管的生長，降低β-catenin蛋白的表達，具有較好的抗腫瘤作用，全方效果較好，其不同拆方在抗癌療效方面有所側重，但作為整方的有機組成從不同環節發揮了協同作用，其機制尚待深入研究。