miR-146b-3p通過靶向BTG2基因調控肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制研究

賀麗娜 劉 力 賀曉旭 王建鈞 何 松

湘南學院附屬醫院肝膽外科 (湖南 郴州, 423000)

肝癌是原發于肝臟的惡性腫瘤，是我國腫瘤致死的主要原因之一，嚴重威脅著國人的健康和生命[1]。近年來，由于外科治療、現代影像技術和個性化治療的不斷改進，肝癌的治療水平已得到了極大的提高，但是肝癌患者的預后仍然不能令人滿意[2]。肝癌預后不良的主要原因是肝癌的早期診斷困難、肝癌易于復發和轉移[3]， 并且缺乏早期診斷和預后預測的生物標志物[4]。因此，迫切需要了解肝癌發生的分子機制，尋找肝癌早期診斷和轉移的生物標志物，以開發更有效的肝癌治療方法。越來越多的證據表明，微小RNA(miRNA)在癌癥的發生和發展中起著重要作用，例如靶向調控癌基因或癌抑制基因[5,6]。miRNA的表達具有細胞和組織特異性，且在進化上比較保守，因此被認為可作為癌癥預后的生物標志物和癌癥治療的潛在靶標。miR-146b-3p是一種致癌miRNA。既往研究顯示，miR-146b-3p在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝組織，其被鑒定為肝癌潛在的預后生物標志物[7]。然而miR-146b-3p在肝癌中的作用及可能的分子機制尚不清楚。本課題通過干擾肝癌Huh7細胞中miR-146b-3p的表達，觀察對Huh7細胞增殖、侵襲和遷移的影響，并探究其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 人正常肝細胞系L025和人肝癌細胞系Huh7、MHCC97-H、HCCLM3(中國科學院上海細胞研究所)；DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(北京雷根生物技術有限公司)；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；miR-146b-3p inhibitor、inhibitor control、miR-146b-3p mimics和mimics control(廣州銳博生物科技有限公司)；BTG2特異性siRNA和非特異性siRNA(上海吉瑪制藥有限公司)；Dual-Luciferase熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；MTT試劑(上海酶聯生物科技有限公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；野生型BTG2 3′UTR(BTG2-Wt)熒光素酶重組載體質粒和突變型BTG2 3’UTR(BTG2-Mut)熒光素酶重組載體質粒(美國Sigma公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；ECL化學發光試劑(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜、BTG2抗體(美國Abcam公司)；辣根過氧化酶標記的二抗(美國CST公司)。

1.2 細胞培養 所有細胞系均培養在含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養液中，將細胞放置在體積分數為5% CO2、37℃恒溫培養箱中常規培養，在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，隔天進行換液。待細胞鋪滿瓶底80%以上時用胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.3 細胞轉染和分組 將生長狀態良好的Huh7細胞種植于6孔板中，放置在37℃培養箱繼續培養，待細胞生長密度達50%左右時，采用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染miR-146b-3p inhibitor、BTG2特異性siRNA及陰性對照，其中轉染miR-146b-3p inhibitor的Huh7細胞作為anti-miR-146b-3p組，轉染inhibitor control的Huh7細胞作為anti-NC組，轉染空脂質體的Huh7細胞作為Ctrl組；共轉染miR-146b-3p inhibitor和BTG2特異性siRNA的Huh7細胞作為anti-miR-146b-3p+si-BTG2組，共轉染miR-146b-3p inhibitor和非特異性siRNA的Huh7細胞作為anti-miR-146b-3p+si-NC組。各組Huh7細胞轉染后放置于37℃培養箱繼續培養48 h。

1.4 qPCR檢測 參照Trizol試劑使用說明書提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒行qPCR檢測，條件設為：95℃ 5 min，隨后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 20 s，共設40個循環，以U6為內參，采用相對量2-△△Ct法分析miR-146b-3p相對表達水平。miR-204-3p正向引物：5′-GTCTGAGACTAGGGCCAGAGGC-3′；反向引物5′-GACATGGGAGTGGAGTGACAGG-3′。U6正向引物5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′；反向引物5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。

1.5 Western blot檢測 使用蛋白提取試劑盒常規提取總蛋白，以BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行檢測，在蛋白樣品中加入適量上樣緩沖液，加熱致蛋白變性。取等量蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉印至PVDF膜上，將膜浸入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，依次加入相應稀釋的BTG2一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，按照ECL發光試劑盒進行顯影，轉移到暗室曝光并采集圖像，使用Image J圖像分析計算BTG2蛋白相對表達水平。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗 通過生物信息學在線數據庫TargetScan預測，結果顯示miR-146b-3p和BTG2 3′UTR存在互補配對堿基，根據預測結果構建BTG2-Wt和BTG2-Mut熒光素酶重組載體質粒(由公司完成)。分別將BTG2-Wt和BTG2-Mut重組載體質粒分別與miR-146b-3p mimics或mimics control共轉染Huh7細胞，48 h后收集各組細胞，采用Dual-Luciferase熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計算細胞相對熒光素酶活性。

1.7 MTT檢測 生長狀態良好的各組Huh7細胞以5×103個/孔種植到96孔板中，于37℃培養箱培養，分別培養24 h、48 h和72 h時，向細胞中添加100 μl MTT溶液，孵育4 h，再添加150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使用酶標儀檢測細胞在波長為450 nm處吸光度值(OD值)。

1.8 Transwell實驗 Matrigel基質膠于4℃冰箱融化，以不含血清的培養液進行稀釋，取100 μl稀釋的Matrigel膠加入Transwell小室的上室，放置在37℃培養箱靜置5 h備用。收集各組Huh7細胞，用不含血清的培養液饑餓處理12 h，隨后將細胞密度調整為2.0×105/ml，將200 μl細胞懸液加入Matrigel膠包被的Transwell上室(遷移實驗Transwell上室未包被Matrigel膠)，600 μl含10%胎牛血清的培養液加入到下室，37℃繼續孵育48 h。用棉簽擦去未穿膜的細胞，隨后用甲醛固定，用結晶紫染色，在顯微鏡下計數侵襲和遷移細胞數。

2 結果

2.1 miR-146b-3p和BTG2在肝癌細胞中的表達 與人正常肝細胞系比，人肝癌細胞系(Huh7、MHCC97-H、HCCLM3)中miR-146b-3p的表達水平明顯上調(P<0.05)，BTG2的表達明顯下調(P<0.05)。在肝癌Huh7細胞中的表達水平差異最顯著，因此后續選擇Huh7細胞為研究對象。見圖1。

圖1 miR-146b-3p和BTG2在肝癌細胞中的表達

2.2 轉染miR-146b-3p inhibitor對Huh7細胞miR-146b-3p和BTG2表達的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組Huh7細胞中miR-146b-3p的表達的表達水平明顯降低(P<0.05)，BTG2的表達水平明顯升高(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組中miR-146b-3p和BTG2的表達水平差異均不顯著(P>0.05)。見圖2。

圖2 轉染miR-146b-3p inhibitor對Huh7細胞中miR-146b-3p和BTG2表達的影響

2.3 miR-146b-3p靶向調控BTG2 生物信息學在線數據庫TargetScan預測發現，BTG2 3′UTR區域存在與miR-146b-3p結合的位點，提示BTG2可能是miR-146b-3p的直接靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，過表達miR-146b-3p能夠明顯抑制BTG2-Wt細胞的相對熒光素酶活性(P<0.05)，而對BTG2-Mut細胞的相對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖3。

圖3 miR-146b-3p靶向BTG2

2.4 干擾miR-146b-3p對Huh7細胞增殖的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組Huh7細胞在轉染48 h和72 h時增殖活力明顯降低(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組Huh7細胞在24 h、48 h和72 h時增殖活力差異均不顯著(P>0.05)。見圖4。

圖4 干擾miR-146b-3p對Huh7細胞增殖活力的影響

A：qPCR檢測各細胞系中miR-146b-3p的表達水平；B：Western blot檢測各細胞系中BTG2的表達水平；C：BTG2在各細胞系中表達水平比較： 與L025細胞系比較，*P<0.05

A：qPCR檢測各組Huh7細胞中miR-146b-3p的表達水平；B：Western blot檢測各組Huh7細胞中BTG2的表達水平；C：BTG2在各組Huh7細胞中表達水平比較；與anti-NC組比較，*P<0.05

A：miR-146b-3p與BTG2 3’UTR靶向結合示意圖；B：雙熒光素酶報告基因實驗驗證BTG2是miR-146b-3p的靶基因；與miR-NC組比較，*P<0.05

2.5 干擾miR-146b-3p對Huh7細胞侵襲和遷移的影響 與anti-NC組比較，anti-miR-146b-3p組侵襲和遷移細胞數均明顯降低(P<0.05)。與Ctrl組比較，anti-NC組侵襲和遷移細胞數差異均不顯著(P>0.05)。見圖5。

A：Transwell實驗檢測各組Huh7細胞侵襲能力；B：Transwell遷移實驗檢測各組Huh7細胞遷移能力；C：各組Huh7細胞侵襲細胞數比較；D：各組Huh7細胞遷移細胞數比較；與anti-NC組比較，*P<0.05

2.6 沉默BTG2逆轉干擾miR-146b-3p對Huh7細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用 與anti-miR-146b-3p+si-NC組比較，anti-miR-146b-3p+si-BTG2組Huh7細胞中BTG2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，侵襲和遷移細胞數明顯增多(P<0.05)；與anti-miR-146b-3p組比較，anti-miR-146b-3p+si-NC組Huh7細胞中BTG2蛋白表達水平、細胞增殖活力、侵襲和遷移細胞數差異均不顯著(P>0.05)。見圖6。

圖6 沉默BTG2對干擾miR-146b-3p調控的Huh7細胞增殖、侵襲和遷移的影響

3 討論

肝癌一直是人類最致命和最普遍的惡性腫瘤之一，而肝細胞癌是最常見的肝癌類型，占所有病例的90%以上。近幾十年來盡管在肝癌的診斷和治療方面取得了一定的進展，但肝癌患者的預后仍然很差，主要由于腫瘤轉移和復發導致患者5年生存率低下[8]。因此，了解肝癌發病機制，開發針對該疾病的有效早期診斷技術和系統性治療策略對于提高患者生存率至關重要。目前，大量研究主要集中在鑒定新的、特異性的生物標志物，以用于肝癌診斷、治療和預后預測[9,10]。miRNA的異常表達與許多人類疾病的發生和發展有關，例如癌癥、神經發育障礙和心血管綜合征[11,12]。證據表明，許多miRNA在肝癌患者的血清和血漿以及肝癌細胞和組織中都存在異常表達[13]。因此，miRNA可作為新型臨床標志物用于肝癌的早期診斷、治療監測和預后預測。miR-146b-3p和miR-146b-5p是來自同一基因的兩個同工型，具有不同的序列并用于調節不同的基因表達。目前對miR-146b-5p的研究比較深入，研究顯示miR-146b-5p可調節多種腫瘤細胞生長和轉移，且其表達水平與患者預后不良密切相關[14-16]。然而，關于miR-146b-3p在肝癌中的作用及機制仍未明確。本實驗首先通過qPCR檢測了miR-146b-3p在肝癌細胞系中的表達情況，結果發現miR-146b-3p在肝癌細胞中的表達明顯高于正常肝細胞。在肝癌Huh7細胞中轉染miR-146b-3p inhibitor后，Huh7細胞增殖活力明顯降低，侵襲和遷移細胞數明顯減少，這提示干擾miR-146b-3p能夠抑制肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移能力。

眾所周知，miRNA和靶標mRNA之間的相互作用形成了一個復雜的網絡，該網絡調節眾多的細胞過程，包括細胞增殖、細胞凋亡、細胞侵襲和轉移以及信號轉導和器官發育的調節[17]。B細胞易位基因2(BTG2)蛋白在各種癌癥類型中均被認為是腫瘤抑制因子[18-20]。有研究顯示，BTG2的表達水平與肝細胞癌患者預后相關，BTG2的過表達促使體外Huh7細胞和裸鼠模型中對輻射誘導的凋亡敏感[21]。另一項研究顯示，下調BTG2的表達能夠促進肝癌細胞的增殖[22]。本研究前期預實驗通過生物信息學預測發現，miR-146b-3p和BTG2存在靶向關系，然而，miR-146b-3p是否能夠通過靶向BTG2調控肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的研究鮮有報道。本實驗qPCR檢測結果顯示，miR-146b-3p在肝癌細胞系中呈高表達，而BTG2在肝癌細胞中呈低表達。且干擾miR-146b-3p能夠上調BTG2的表達，熒光素酶報告實驗結果表明，miR-146b-3p和BTG2間存在靶向關系，這些數據表明miR-146b-3p能夠靶向調控BTG2的表達。為進一步探究miR-146b-3p靶向BTG2來影響肝癌細胞增殖、侵襲和遷移，本實驗在Huh7細胞中共轉染miR-146b-3p inhibitor和BTG2 siRNA，通過BTG2功能恢復實驗探究BTG2對miR-146b-3p調控的Huh7細胞增殖、侵襲和遷移的影響。結果發現，沉默BTG2能夠逆轉干擾miR-146b-3p對Huh7細胞增殖、侵襲和遷移能力的抑制作用。本實驗數據表明miR-146b-3p可通過靶向BTG2調控肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移。

綜上，miR-146b-3p在肝癌細胞系中表達上調，干擾miR-146b-3p能夠通過靶向調控BTG2的表達抑制肝癌Huh7細胞增殖、侵襲和遷移。然而miR-146b-3p是否靶向其他靶基因參與肝癌細胞生物學行為的調控尚未可知，尚需進一步的深入探究。本實驗結果提示，miR-146b-3p可作為肝癌診斷和治療的靶標提供新的實驗依據。