基于網絡藥理學探討陰陽攻積丸治療肝細胞癌的潛在作用機制*

李玉潔 陳 燕 楊宏志 李永偉 李 躍 張炯善 鄒增城

中山大學附屬第三醫院 (廣東 廣州， 510630)

肝細胞癌(HCC)是一種具有多種危險因素的惡性腫瘤疾病，是原發性肝癌的主要病理類型。目前HCC的常用治療方法有手術切除術、經肝動脈化療栓塞術、射頻消融、分子靶向治療、肝移植。中西醫結合治療越來越受到重視。明·李中梓在《醫宗必讀·積聚》中創制了一首癥積通用方：陰陽攻積丸，是治五積、六聚、七癥、八瘕、痃癖、蟲積、痰食的良方[1]。網絡藥理學作為一門新興學科，為中藥方劑的研究提供了新的方法[2]，可從整體上展示藥物靶點的網絡[3]；使用網絡藥理學方法對理解藥物的多重藥理作用和藥物對生物網絡的影響也具有重要意義[4]。筆者利用網絡藥理學方法探討陰陽攻積丸治療HCC的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 中藥復方活性成分及其作用靶點的收集和篩選 通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/) 分別檢索陰陽攻積丸中20味中藥。TCMSP是一個提供有關中草藥成分的全面信息的數據庫，如化學結構、口服生物利用度、腸上皮通透性、水溶性、藥物相似性、藥物靶點以及它們與疾病的關系[5]，也包括吸收、分布、代謝和排泄(ADME)在內的藥代動力學特性。本研究采用口服生物利用度(OB)和藥物相似度(DL)2個ADME相關參數來預測陰陽攻積丸潛在的活性成分。OB被廣泛用于評價藥物克服吸收障礙進入血液循環系統的能力，是通過計算藥物與細胞色素P450和P-糖蛋白的關系來確定的[6]，OB值≥30%的患者口服后吸收良好。DL通過計算與已知藥物的相似度來表示潛在成分成為有效藥物的能力，值不小于0.18，表明該化合物在化學上適合藥物開發[7]。因此，以OB≥30%和DL≥0.18作為活性成分在陰陽攻積丸中的納入標準，并收集其作用的相關靶點。

1.2 肝細胞癌相關靶標基因的獲取及收集 GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)是一個人類基因相關的綜合數據庫[8]，OMIM數據庫是在線人類孟德爾遺傳，包括對人和動物所有生物有關基因進行記載。在兩個數據庫中輸入關鍵詞“hepatocellular carcinoma”或“HCC”進行檢索，獲取肝癌相關靶點基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點確定 通過繪圖軟件venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分別錄入陰陽攻積丸中活性成分相關的靶點與HCC的靶點，篩選出兩者的共同靶點基因，作為陰陽攻積丸治療HCC的潛在作用靶點，并繪制韋恩圖(venn)。再運用Cytoscape 3.6構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，使二者靶點作用關系可視化。Cytoscape是一個網絡可視化和分析的軟件，將相互聯系的事物、其間錯綜復雜的作用關系呈現可視化，運用計算機科學算法對網絡性質進行分析，且聯合大的數據庫對生物網絡參數綜合評價，綜合生物信息學理論對分子生物功能進行注釋[9]。在生成的網絡中，每個節點(node)代表著基因、蛋白質或分子, 而節點與節點之間連接的邊(edge)代表著這些生物分子之間的相互作用關系。

1.4 蛋白之間互作網絡(PPI)構建及核心靶點的確定 將藥物-疾病共同靶點導入STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/Version11.0)，設置蛋白種類為“homo sapiens”，獲得蛋白互作關系圖。排除邊緣游離蛋白，將最高置信度蛋白質參數評分值設置為>0.4，并將結果以TSV格式導出以便后續的分析。通過R語言軟件計算得出核心靶點，依據蛋白互作次數，確定核心靶點蛋白。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 為了說明中藥化合物對應的預測靶點在基因功能和通路中的作用，采用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對PPI網絡中的蛋白質進行基因本體論(GO)生物學功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO是根據現有研究對各種生物基因和蛋白質功能進行限定和描述，主要包括：細胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)3大模塊。KEGG數據庫是基于基因組測序和其他髙通量實驗技術從基因水平系統描述高級生物功能和生物系統(如細胞、生物和生態系統)的實用程序數據庫資源[10]。

2 結果

2.1 陰陽攻積丸候選活性成分與候選靶點 通過對TCMSP數據庫的檢索和篩選一共收集到226個化學成分，其中重復38個，保留唯一的188個候選活性成分見表1。同時針對每個有效活性成分，獲取陰陽攻積丸中的潛在作用靶標，去除無效和重復后得到878個。根據組方君臣佐使原則，利用韋恩圖分析活性化合物及其靶點在陰陽攻積丸中的分布，見圖1。

圖1 活性化合物在陰陽攻積丸中的分布(A) 潛在靶點在陰陽攻積丸中的分布(B)

表1 陰陽攻積丸的活性成分(DL值前10)

2.2 陰陽攻積丸抗癌的潛在作用靶點預測 經GeneCards數據庫、OMIM數據庫檢索收集并去重后，得到HCC疾病的潛在作用靶點7 100個。運用venny軟件得到藥物活性成分相關的靶點和疾病靶點的共同靶點基因110個，作為陰陽攻積丸治療HCC的預測靶點；并導入UniProt 數據庫經Target-ID配對獲取這些靶點基因相對應的UniProt ID，見表2。

表2 陰陽攻丸潛在作用靶標信息

2.3 GO功能富集分析 采用DAVID 6.8數據庫對110個潛在作用靶點進行GO基因本體分類富集分析，結果顯示，生物過程確定了123個GO條目，前20個條目主要涉及DNA結合轉錄激活活性(DNA-binding transcription activator activity), RNA聚合酶II特異性(RNA polymerase II-specific)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇激素受體(steroid hormone receptor activity)、血紅素結合(heme binding)、類固醇結合(steroid binding)和半胱氨酸型內肽酶活性與細胞凋亡(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)等過程。表明陰陽攻積丸可以通過參與調控大量不同類型的生物學過程而發揮抗癌作用。用R語言繪制高級氣泡圖，其中縱坐標代表GO條目名稱，橫坐標代表基因的比例，即陰陽攻積丸中有治療肝癌作用的110個基因富集在該條GO條目上的個數與富集在該條GO條目上的總基因個數的比值；氣泡大小代表基因個數，氣泡越大，表示富集在該條GO條目上的基因個數越多，氣泡的顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，P值越小。見圖2。

圖2 GO功能富集分析氣泡圖

2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID 6.8數據庫對篩選出的110個潛在作用靶點進行KEGG通路富集分析，從KEGG富集分析結果共確定116條信號通路。富集基因數的前20條通路：乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細胞凋亡(Apoptosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、癌癥中的MicroRNAs(MicroRNAs in cancer)甲狀腺激素信號通路(Thyroid hormone signaling pathway)等，即陰陽攻積丸治療肝癌的核心靶點主要通過以上通路起作用。用R語言繪制高級氣泡圖，直觀的表明陰陽攻積丸活性成分的靶點分布于多種通路。其中縱坐標代表KEGG名稱，橫坐標代表基因比例，即陰陽攻積丸中有治療肝癌作用的110個基因富集在該條KEGG通路上的個數與富集在該條KEGG通路上的總基因個數的比值；氣泡大小代表基因個數，氣泡越大，表示富集在該條KEGG通路上的基因個數越多，氣泡的顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，P值越小見圖3。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 運用Cytoscape 3.6.0構建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的可視化網絡見圖4，該網絡包含247個節點和871條邊,其中桔色長方形代表藥物,黃色三角形代表成分，綠色橢圓形代表靶點蛋白,藍色菱形代表疾病，邊代表相互關系。其中Degree值較大的活性成分有槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、黃芩素(baicalein)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等，通過此網絡驗證了陰陽攻積丸治療肝細胞癌是通過多成分、多靶點的方式發揮作用的。

圖4 陰陽攻積丸治療肝癌的“藥物-活性成分-靶點-疾病”

2.6 PPI網絡構建及陰陽攻積丸作用于肝癌核心蛋白的確定通過STRING 11.0數據庫在線構建PPI蛋白網絡圖，設置蛋白種類為“homo sapiens”，得到蛋白互作網絡圖見圖5，該網絡共有110個節點，1 153條邊，PPI enrichment p-value<1.0e-16。其中每個節點就是靶點蛋白，節點與節點之間連接的邊表示靶點蛋白之間的相互作用，邊越多表示靶點間的作用關系越強。藍色邊來自數據庫收集的蛋白作用關系，粉色邊則來自實驗驗證。在Setting模塊將最高置信度蛋白質參數評分值設置為>0.4,同時設置隱藏游離蛋白后導出TSV格式文件，用R語言軟件運算得到核心靶點，篩選p值最小的前30個繪制 barplot條形圖見圖6，即陰陽攻積丸中的 IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC等可能是作用于肝癌的關鍵靶點。

圖5 陰陽攻積丸治療肝癌相關基因的蛋白質相互作用網絡

圖6 PPI圖中的靶點排序(排名前 30)

3 討論

晚期肝癌患者主要依靠靶向藥物治療，但帶來的毒副作用以及對藥物產生的耐藥性使我們尋找新的HCC治療藥物和治療策略具有重要意義。與西藥“一靶一藥”不同，由于中藥成分的復雜性，其多種成分和靶點的協同作用，在治療HCC方面顯示出優勢[11]。將系統生物學與計算機技術相結合的網絡藥理學方法，已成為從分子水平到通路水平描述復雜中藥復方作用機制的有用工具，是研究中醫藥作用機制和開發新藥前期高效的預測方法[12]。本研究通過構建陰陽攻積丸“藥物-活性成分-靶點-疾病”關系網絡，從多個角度探索陰陽攻積丸治療HCC的潛在分子機制。

本研究所收集的陰陽攻積丸治療HCC的有效成分有188個，通過“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡拓撲分析發現，槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩素、異鼠李素等可能是本方發揮作用的重要活性化合物。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，通過抑制PI3K通路來達到抗癌作用[13]，它已被證實可誘導SMMC-7721細胞凋亡，其機制可能與PTEN的過表達抑制AKT活化有關[14]。山奈酚是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的膳食類黃酮，因其具有抗腫瘤作用而受到重視。Guo等[15]研究發現山奈酚通過誘導內質網應激CHOP信號通路促進HepG2細胞凋亡，Zhu等[16]則發現山奈酚通過使PI3K/Akt/mTOR信號通路失活來抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲。木犀草素在20μM濃度下可以引起HepG2細胞周期滯留在G2/M期, 通過阻滯其生長周期進而發揮抗腫瘤效應[17]。黃芩素能抑制INF-γ誘導的SMMC-7721和HepG2細胞的PD-L1表達，從而恢復T細胞殺傷腫瘤細胞的敏感性，抑制腫瘤的生長[18]。異鼠李素一種從中藥甘草中提取的黃酮苷元，被證明具有體外抗肝癌細胞的活性[19]，Choi[20]首次發現異鼠李素通過將細胞周期阻滯在G2/M期來抑制人肝癌Hep3B細胞的增殖。我們前期實驗采用高效液相檢測到陰陽攻積丸含有異鼠李素，可能是該方的抗癌成分之一[21]。因此，初步可推測以上化合物很可能是陰陽攻積丸治療HCC的相關藥效物質。

此外，通過分析陰陽攻積丸抗HCC的110個共同靶點構建的PPI網絡，發現白細胞介素-6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)和MYC是計算度最高的核心基因。IL-6是一種在腫瘤發展中發揮重要調節作用的促炎細胞因子，He等[22]研究發現HCC中高表達IL-6與肝癌的惡性進展關系密切。VEGFA是較強的促血管生長因子，在腫瘤發展過程中具有重要作用，可促進內皮細胞增殖、增加細胞外基質合成，是抗腫瘤血管生成藥物治療的重要靶點[23]。EGFR是上皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導的受體,HCC組織中EGFR的表達顯著高于癌旁組織[24]。CASP3是細胞凋亡的一種檢測指標，它可通過抑制p38活化和肝細胞凋亡來預防化學誘導的肝癌發生[25]。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1(JNK1), 是MAPKs家族的重要成員之一，Sakurai等[26]研究發現JNK1可上調VEGFA的表達來促進腫瘤細胞增殖和血管生成。Hui[27]也發現JNK1可影響p21和c-Myc的表達促進人肝癌細胞的增殖。MYC是較早發現的一組癌基因，有研究發現MYC癌基因的失活足以誘導浸潤性肝癌的持續消退[28]；我們之前的體外實驗結果表明，10%陰陽攻積丸含藥血清能顯著下調MHCC97H和HepG2細胞的c-Myc表達[29]。

通過KEGG通路富集分析可發現，陰陽攻積丸主要干預了Hepatitis B、PI3K-Akt、TNF、MAPK、p53等信號通路來實現對肝癌的調控。HBV感染是HCC發生的重要誘因，抗病毒治療可降低患者乙肝病毒載量、抑制病毒復制、延緩肝硬化的進展，從而減少乙型肝炎相關性肝癌的發生。Liu等[30]研究發現肝癌細胞中Akt的表達明顯高于正常肝組織，中藥可通過干預PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導細胞凋亡，抑制肝癌細胞生長[31]，因此，PI3K/Akt通路可成為治療肝癌的靶點。TNF是腫瘤微環境中重要的炎性細胞因子，包括TNF-α和TNF-β；在肝癌的發展中有著重要作用，顧星等[32]研究發現通過影響TNFα/NF-κB信號通路活化,可抑制肝癌細胞增殖。MAPK信號通路的異?；罨谝倚透窝紫嚓P性肝癌中發揮的重要作用[33]。有研究發現HBX可以通過抑制EphA2的表達阻斷p38MAPK和ERK1/2信號通路，減少了HBV的復制，進而抑制腫瘤細胞的生長[34]。腫瘤抑制因子P53是一種轉錄因子, 在調控細胞凋亡、細胞周期和衰老中發揮重要的作用，研究結果表明黃芪蛋白、藤茶總黃酮等活性成分都是通過激活p53信號通路發揮抗肝癌的治療作用[35,36]。富集結果涵蓋了多個腫瘤信號通路，因此推測陰陽攻積丸可從多方面干預調控肝癌發展。

綜上所述，通過網絡藥理學方法體現了中藥多成分、多靶點和多途徑的治療作用，初步明確了陰陽攻積丸治療肝癌的潛在作用機制，通過構建的“藥物-成分-靶點-通路”網絡，為陰陽攻積丸臨床用藥提供了理論依據。由于網絡藥理學的方法有一定局限性，后續研究需要選取活性成分對核心靶點進行驗證。