探討QF-PCR在產前篩查中的臨床應用

譚放，馮拓宇，楊嬌英

（湛江市婦幼保健計劃生育服務中心，廣東 湛江 524000）

0 引言

三體型和單體型最為常見染色體非整倍體異常情況。最常見的疾病有21三體綜合征、Turner綜合征（45，X）、18三體綜合征和Klinefelter綜合征（47，XXY）[1]。對于這種疾病，臨床檢測金標準是傳統羊水細胞培養染色體核型分析技術，可以發現染色體數目、結構是否存在異常，但羊水培養周期較長，且操作要求嚴格孕婦，一旦失敗，就需要二次穿刺，在孕婦中接受度較低[2]。定量熒光PCR技術（QF-PCR）通過對染色體上多態性短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）位點進行擴增，經過高分辨率膠電泳（如毛細管電泳等）對產物進行分離，是第二代遺傳標記方法，其特點是檢測簡便、快捷[3]。目前醫學對于染色體病還沒有有效的治療方法，因此在產前進行診斷篩查意義重大。本次研究將探討QF-PCR的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料。經我院倫理委員會批準，選取2020年7~12月在湛江市婦幼保健計劃生育服務中心產前診斷中心就診的高危孕婦289例，風險指標主要包括高齡、唐篩高風險、超聲發現胎兒超聲軟指標異常及夫婦雙方同型地中海貧血。所有孕婦均已被告知檢測風險且已簽訂知情同意書，均無羊水穿刺相關禁忌證。受檢孕婦年齡17~46歲，平均（32.51±2.09）歲，孕周16~27周，平均（19.21±2.63）周。

1.2 方法

1.2.1 對289例孕婦進行介入性穿刺，抽取20~25 mL羊水，分成15 mL和8 mL分別保存在兩支無菌離心管。

1.2.2 染色體核型分析：將裝有15 mL羊水的無菌離心管送至細胞遺傳室，進行常規細胞培養及制片G顯帶，核型分析參照ISCN（2016）標準。

1.2.3 QF-PCR：根據提取劑盒說明書提取羊水細胞DNA，所提DNA均用Qubit4.0檢測DNA濃度以備用。檢測試劑盒由達瑞公司提供。部分懷疑母源污染的標本，抽取2 mL母血檢測其STR位點加以排除。對每個標本分A（21染色體）、B（18/13染色體）、C（X/Y染色體）三個體系進行擴增；每份檢測取1μl PCR產物和13.5μL甲酰胺、0.5μl GeneScanTM600 LIZ? Size standard v2.0（內標）混合，95℃變性5分鐘，放冰上至少1 min，將混合物置ABI3500Dx基因分析儀進行上樣操作，用GeneMapper軟件進行數據收集和分析。

1.2.4 QF-PCR染色體非整倍體判斷 根據臨床生化協會/臨床分子遺傳協會（ACC/CMGS）規定判斷標準如下：STR位點上等位基因擴增后顯示為3個熒光峰，峰值面積比接近于1∶1∶1，可直接判斷為三體型。

若只顯示兩個峰，則計算兩個峰的峰面積比值，凡雙峰面積比值>1.8或者<0.65則可判定為三體。

正常雙峰面積比值區間為0.8-1.4，介于兩個區間之間的值無法判斷，需重新檢測。

每個染色體至少2個 STR 位點能提供信息且為異常峰型，才能診斷此樣本為相應染色體異常。

45，X診斷標準：所有的 X 染色體STR呈單峰[4]。

檢測所用STR位點、位置如下：

13號染色體標記及位置：D13S305（13q13.3）、D13S628（13q31.3）、D13S634（13q21.32）、D13S742（13q12.12）。

18號染色體標記及位置：D18S1002（18q11.2）、D18S386（18q22.1）、D18S391（18p11.31）、D18S535（18q12.3）。

21號染色體標記及位置：21q11.2（21q11.2）、D21S1411（21q22.3）、D21S1412（21q22.2）、D21S1414（21q21.1）、D21S1433（21q21.1）。

XY特異性標記及位置：DXS1187（Xq26.2）、DXS6809（Xq21.33）、DXS8377（Xq28）、DXS981（Xq13.1）、AMXY（Xp22.2/Yp11.2）。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果。289例標本中，檢出正常核型258例，21、18、13、X、Y染色體非整倍體31例。

2.2 QF-PCR結果。正常（46，XX或46，XY）有256例，異常有30例，分別為21三體15例、18三體5例、13三體1例，性染色體非整倍體6例（X0 2例，XXX 1例，XXX或XX/X0嵌合體1例，XXY1例，XYY1例），3例標本存在母源污染。

2.3 兩種方法檢測結果一致性為96.77%（30/31），異常檢測結果一致性100%，詳見表1。

表1 染色體核型分析與QF-PCR檢測結果比較

3 討論

染色體非整倍體是出生缺陷中的主要原因之一，最常見有唐氏綜合征，給家庭造成巨大的精神和經濟壓力，對社會也是一種負擔。因此針對高風險孕婦在孕期做相關檢查對預防染色體非整倍體是很有意義的。但是產前篩查結果為陽性不代表相關疾病的發生，而是提示患病風險存在，且比正常陰性結果發生概率高。而結果提示陰性也不完全排除疾病的發展，僅代表發生風險低[5]。

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型（數目、大小、形態特征等），對此進行分析對于探討人類遺傳病的機制、物種親緣關系與進化、遠緣雜種的鑒定均有重要意義[6]。染色體核型能發現染色體結構及數目異常，是染色體病檢測的金標準[7]。經染色體核型分析，本研究的289例羊水標本中檢出21、18、13、X、Y染色體非整倍體31例，正常核型258例。本研究應用QF-PCR技術，通過對染色體上STR位點進行擴增，結果顯示，正常（46，XX或46，XY）256例，異常30例（21三體15例、18三體5例、13三體1例），性染色體非整倍體6例（X0 2例，XXX 1例，XXX或XX/X0嵌合體1例，XXY1例，XYY1例），3例存在母源污染。QF-PCR在臨床上廣泛用于染色體非整倍體檢測，不僅有高度靈敏性，而且具有高準確性和高特異性，在染色體非整倍體中具有較高的診斷率[8]。本研究將QF-PCR檢測結果與染色體核型分析檢測結果進行對比，檢測結果一致性為96.77%，其中異常檢測結果一致性為100%，結果證實QF-PCR應用于染色體非整倍體的診斷中有較高的準確性。

綜上所述，在產前診斷中，QF-PCR技術可準確快速檢出染色體非整倍體情況，雖只是一種篩查技術，但在實際應用中可作為染色體核型分析的有效補充，在快速產前診斷中具有重要價值。