鞣花酸對缺血性腦卒中大鼠的保護作用

陳敏純， 張婧一， 張雨晨， 葉 丹， 閆抗抗， 劉生元

(西北大學附屬醫院/西安市第三醫院藥劑科，陜西 西安 710018)

缺血性腦卒中嚴重危害人類健康，其致病率、死亡率在全球居首位[1]。由于其病理機制復雜，迄今尚無理想的治療藥物和措施。尋找安全、療效顯著、作用機制確切的腦卒中防治藥物成為治療該疾病的迫切需求。目前，以抗氧化應激為靶點治療缺血性腦卒中的藥物研究日趨成為醫藥領域研究熱點。近年來的研究發現，PGC-1α/Nrf2是抗腦缺血損傷和神經退行性疾病的重要生存通路，PGC-1α/Nrf2通路參與調控氧化應激功能累及的多種因子、多個環節的復雜反應從而挽救神經元損傷[2-3]。鞣花酸是一種多酚物質，廣泛存在于石榴、赤芍、柯子等食藥中，具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡作用[4-5]，課題組前期研究證實它具有抗動脈粥樣硬化血管保護作用[6]，但能否調控PGC-1α/Nrf2信號通路，抑制氧化應激，從而發揮腦保護作用尚不清楚。本研究以大鼠中動脈栓塞為缺血性腦卒中模型(MCAO)，考察鞣花酸對缺血性腦卒中抗氧化應激的保護作用，并探討其調控機制，為將其開發成新型安全防治缺血性腦卒中藥物提供理論依據，同時揭示相關作用機制。

1 材料

1.1 儀器、藥物與試劑 脫水機、組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司，JT-12J、JK-6)；病理切片機(德國Leica公司，RM2016)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，BX53型)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，HI650)；全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司，Multiskan MK3)；蛋白免疫印跡系統(美國Bio-Rad公司)。鞣花酸(美國Sigma-Aldrich公司)。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche Applied Science公司)；抗熒光淬滅封片劑(美國Southernbiotech公司)；DAPI(上海碧云天生物技術有限公司)；CD34(英國Abcam公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PGC-1α抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；Nrf2抗體(美國Affinity公司)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量180～220 g，8～10周齡，購自空軍軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK-(陜)-2014-002。大鼠自由取食和飲水，適應性飼養1周后進行實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 大鼠適應性飼養7 d后開始實驗，40只大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、鞣花酸低劑量組(50 mg/kg)、鞣花酸中劑量組(100 mg/kg)、鞣花酸高劑量組(150 mg/kg)，每組8只。正常組不插入線栓，其余操作同模型組，缺血性腦卒中模型制作參考Qiang等[7]報道，分離大鼠頸總動脈和頸內外動脈，將線栓插入頸內動脈約18 mm處，阻塞顱內中動脈，缺血2 h后取出線栓。應用Garcia評分，按照每項反應程度對清醒后大鼠進行1、2、3分評定，選取1～2分者作為模型。大鼠造模成功后，鞣花酸溶于生理鹽水中每天灌胃給藥1次，連續7 d，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。

2.2 神經功能評分 給藥結束后，大鼠進行Garcia評分，根據自主運動情況、提起鼠尾懸空時四肢活動的對稱情況、前爪伸展情況、攀爬和抓持鐵網的能力、身體感覺反應、觸碰胡須的反應，按照程度進行1、2、3分評定。

2.3 腦梗死體積檢測 神經功能評分后，麻醉大鼠，斷頭取腦，沿冠狀面進行切片(厚度約2 mm)，浸泡于TTC中，孵育30 min后多聚甲醛固定2 h，計算腦梗死面積。

2.4 腦組織病理學觀察 大鼠腦組織塊進行脫水、透明、石蠟包埋及切片處理，采用蘇木素染色5 min，1%水溶性伊紅染液染色2 min，發現細胞核呈藍色，細胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色，照相倍數為200倍。

2.6 在體細胞凋亡檢測 大鼠腦組織塊進行脫水、透明、石蠟包埋、切片處理后，滴加蛋白酶K工作液反應30 min，PBS洗滌3次后加入50 μL TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育60 min，再滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核。熒光顯微鏡下觀察組織切片上凋亡的細胞呈紅色熒光，藍色為細胞核，照相倍數為400倍。

2.7 腦組織中PGC-1α、Nrf2蛋白表達檢測 提取腦組織蛋白并進行蛋白濃度定量，配制電泳膠，用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40 μg，進行電泳分離，切下目的條帶進行轉膜。將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，再將PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h，顯色曝光，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結果

3.1 神經功能評分 正常組大鼠神經功能正常，模型組神經功能影響最嚴重，與模型組比較，鞣花酸組神經功能改善(P<0.05)，高劑量給藥組神經功能優于低、中劑量給藥組。如表1所示。

3.2 腦梗死體積 正常組大鼠腦組織無梗死體積，模型組大腦梗死體積最大，高達(42.28±2.79)%，與正常組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；而鞣花酸給藥組腦梗死灶縮小，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，以高劑量組最小，說明鞣花酸對缺血性腦卒中大鼠具有神經保護作用，改善腦神經功能，縮小腦梗死灶。如表1所示。

表1 大鼠神經功能評分及腦梗死體積

3.3 腦組織病理學變化 正常組神經元細胞形態基本正常，組織致密，細胞排列整齊，胞核位于細胞中央；模型組腦組織疏松，腫脹明顯，細胞數量減少，排列紊亂，神經元胞核固縮，顏色深染；鞣花酸高劑量組病理學變化較模型組改善。如圖1所示。

圖1 大鼠腦組織HE染色(×200，n=8)Fig.1 Brain tissues of rats by HE staining (×200，n=8)

3.4 氧化應激水平 如圖2所示，與正常組比較，模型組MDA水平增高(16.28±1.31)nmol/mL(P<0.05)；而給予鞣花酸藥物處理后，與模型組比較，MDA水平降低(P<0.05)，高劑量組效果最優[(12.79±2.31)nmol/mL]，表明鞣花酸具有降低脂質過氧化作用。與模型組比較，鞣花酸組增加SOD活性(P<0.05)，高劑量組效果最優[(113.565 ±19.23 U/mL)]，說明鞣花酸有抗氧化作用。

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖2 大鼠腦組織氧化應激水平(n=8)Fig.2 Levels of oxidative stress in brain tissues of rats(n=8)

3.5 在體細胞凋亡 如圖3～4所示，正常組無細胞凋亡；模型組凋亡指數最高[(45.23±2.12)%]，凋亡細胞密集分布；給藥組TUNEL陽性凋亡表達降低(P<0.05)，高劑量組下降至25.31%。

圖3 鞣花酸對MCAO模型大鼠TUNEL陽性細胞數的影響(×400，n=8)Fig.3 Effect of ellagic acid on the number of TUNEL positive cells of MCAO rat models(×400，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖4 鞣花酸對MCAO模型大鼠抗細胞凋亡的影響(n=8)Fig.4 Effects of ellagic acid on the number of TUNEL positive cells of MCAO rat models(n=8)

3.6 腦組織PGC-1α、Nrf2蛋白表達 如圖5所示,與正常組比較，模型組PGC-1α、Nrf2蛋白表達增加(P<0.05)，而給藥組PGC-1α、Nrf2高于模型組(P<0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖5 鞣花酸對MCAO模型大鼠PGC-1α、Nrf2蛋白表達影響(n=8)Fig.5 Effects of ellagic acid on the expressions of PGC-1α and Nrf2 proteins in MCAO rat models(n=8)

4 討論

中醫藥在治療缺血性疾病方面顯示出了獨特的優勢，臨床療效確切[8],認為瘀血阻滯、熱毒壅盛是缺血性腦卒中的主要病機，故以行氣營血、清熱解毒為主要治法[9]。赤芍性微寒，味苦，有破血行氣、清熱解毒、引血下行的功效。課題組前期從赤芍中分離鑒定出一種有效成分鞣花酸具有抗動脈粥樣硬化血管保護作用，本研究顯示鞣花酸對缺血性腦卒中大鼠有保護作用，可顯著改善MCAO模型大鼠的缺血梗死灶，恢復神經功能，緩解缺血灶組織病理學變化。

腦缺血損傷機制眾多，至今尚未完全清楚，以往研究發現，氧化應激損傷在神經細胞凋亡中發揮重要作用。腦缺血缺氧后，細胞內產生大量的活性氧(ROS)，爆發的ROS激活了線粒體凋亡通路，同時使線粒體DNA致突變，轉錄有缺陷的電子傳遞鏈組分，導致ROS瀑布式的增長，加重細胞凋亡。MDA反映的是ROS與不飽和脂肪酸發生過氧化反應的程度，其有細胞毒性作用，本研究顯示鞣花酸降低MDA水平。SOD是體內清除ROS重要的抗過氧化物酶，緩解細胞氧化應激損傷，減少神經細胞凋亡，鞣花酸增加SOD活性。TUNEL結果也顯示鞣花酸降低在體細胞凋亡，且抗凋亡作用呈劑量依賴，表明鞣花酸可調節機體抗氧化應激損傷作用。

以往研究證明腦缺血損傷可增加腦組織的PGC-1α表達，若PGC-1α被抑制則加重腦損傷，表明PGC-1α具有神經保護作用[10]。PGC-1α靶向激活雌激素受體相關受體(ERR)家族蛋白，ERRα促Nrf2高表達，激活下游一系列信號轉錄，修復受損神經元細胞[11]。PGC-1α是線粒體生物合成的重要調控因子，也是線粒體保護的重要靶蛋白。神經元細胞中PGC-1α高表達可增加神經元細胞樹突棘的數量并促進突觸分化[12]。在氧化應激條件下，刺激血管內皮細胞PGC-1α表達能減少線粒體內ROS積累，穩定線粒體膜電位，減少細胞凋亡[13]。Han等[14]研究發現PGC-1α促進了線粒體抗氧化劑(SOD、Prx3、GPx1)和解偶聯蛋白(UCP2、UCP4和UCP5)的表達，進而降低ROS的產生。Nrf2是結合抗氧化反應元件(ARE)的主要轉錄因子，激活下游信號因子ARE，啟動抗氧化基因表達，激活許多維持氧化還原穩態的關鍵基因，如GSH-Px和SOD抗氧化系統的相關基因[15]。這些信號因子參與調控ROS代謝，蛋白酶體功能等。當Nrf2耗竭完，或表達異常下降，致AER介導抗氧化酶基因表達失敗[16]。PGC-1α/Nrf2信號通路是雙向環路相互作用，ROS解毒系統可誘導PGC-1α高表達。本實驗顯示，與模型組比較，鞣花酸給藥組增加腦組織PGC-1α、Nrf2表達，提示它可能為PGC-1α激活劑，其抗氧化應激作用通過調控PGC-1α/Nrf2信號通路表達發揮。

綜上所述，鞣花酸通過激活PGC-1α/Nrf2信號通路，調控氧化應激，修復受損神經元細胞，發揮抗缺血性腦卒中作用。