基于網絡藥理學探討知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機制

房立源 李慧杰 王志鵬 李秀榮

摘要：目的? 基于網絡藥理學探討知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機制。方法? 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）和UniProt數據庫獲取知柏地黃湯有效成分及作用靶點，通過OMIM和CTD數據庫篩選前列腺癌的相關靶點，將有效成分靶點與疾病靶點取交集，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建藥物-有效成分-靶點-疾病網絡，運用String數據庫繪制交集靶點的蛋白相互作用（PPI）網絡，經拓撲分析找出關鍵靶點，并進行GO和KEGG富集分析，運用分子對接技術對主要有效成分與關鍵靶點進行分子對接。結果? 共獲得知柏地黃湯有效成分107個，作用于150個靶點，前列腺癌靶點825個，知柏地黃湯和前列腺癌交集靶點65個，主要有效成分有谷甾醇、槲皮素和山柰酚，關鍵靶點包括JUN、TP53、MAPK1、TNF和MAPK14。GO功能富集得到1668個條目，包括生物過程1527個、分子功能102個、細胞組分39個，KEGG通路富集得到134條通路，主要涉及癌癥途徑和PI3K-Akt信號通路等。分子對接結果顯示，化合物和靶點之間具有較好的結合性。結論? 知柏地黃湯治療前列腺癌具有多成分、多靶點、多通路的特點，可為進一步研究提供理論基礎。

關鍵詞：網絡藥理學;分子對接;知柏地黃湯;前列腺癌;作用機制

中圖分類號：R273;R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：2095-5707（2021）05-0006-07

DOI： 10.3969/j.issn.2095-5707.2021.05.002? ??????開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Exploring the Mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in Treating Prostate Cancer Based on Network Pharmacology

FANG Li-yuan¹， LI Hui-jie²， WANG Zhi-peng²， LI Xiu-rong^2*

（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China; 2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

Abstract： Objective To explore the material basis and mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in the treatment of prostate cancer based on network pharmacology. Methods TCMSP database and UniProt database were used to screen out the active components and target genes of Zhibai Dihuang Decoction. The target genes of prostate cancer were screened out through OMIM and CTD databases. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct the TCM component-target network; String database was used to construct the protein interaction （PPI） network diagram of Zhibai Dihuang Decoction to treat prostate cancer， and it was found the core target through topological analysis. The R database was used for GO analysis and KEGG analysis. Finally， the core?active components were docked with the key targets through molecular docking technology. Results There were 107 active components， 150 gene targets， and 825 prostate cancer disease targets in Zhibai Dihuang Decoction， and 65 intersection targets in Zhibai Dihuang Decoction and prostate cancer. The more effective components were： sitosterol， quercetin and kaempferol， and the key core targets were： JUN， TP53， MAPK1， TNF and MAPK14. GO biological process and KEGG enrichment analysis showed that there were 1668 GO pathways and 134 KEGG pathways involved in cancer pathway and PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking results showed that the core components had good binding energy with the key targets. Conclusion Zhibai Dihuang Decoction has the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway in the treatment of prostate cancer， which provides a theoretical basis for further studies.

Key words： network pharmacology; molecular docking; Zhibai Dihuang Decoction; prostate cancer; mechanism

前列腺癌是老年男性常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一，2018年全球前列腺癌新發患者約127萬，位居新發腫瘤第3位，死亡人數約36萬^[1]。根據我國癌癥中心發布的數據顯示，2015年我國新發前列腺癌患者7.2萬人，位居男性腫瘤新發人數第6位，且新發患者中70%是中晚期，五年生存率為66.4%。美國及歐洲各國新發前列腺癌患者81%處于早期，且五年生存率為99.5%^[2]。前列腺癌早期臨床表現無特異性，多為尿頻、尿急、排尿中斷、尿痛、血尿等，中晚期則以下尿路梗阻、轉移性骨痛、脊髓壓迫神經癥狀和病理性骨折等表現為主^[3]。

前列腺癌屬中醫學“淋證”“癃閉”等范疇，病位在腎與膀胱，病機主要為肝腎陰虛，膀胱濕熱，《諸病源候論·諸淋病候》曰：“諸淋者，由腎虛膀胱熱故也。”中醫通過辨病與辨證相結合，把握前列腺癌的病機特點，靈活處方用藥，隨癥加減，在提高患者生存質量、減輕不良反應方面顯示出確切療效。張亞強認為前列腺癌的病機為本虛邪盛，本虛為氣血虧虛、脾腎兩虛，邪盛為熱、毒、瘀、濕、痰互結，且多為虛實夾雜^[4]。郭軍認為腎氣虧虛是本病發生的根本原因，因虛致實^[5]。如《黃帝內經》所言：“邪之所湊，其氣必虛。”知柏地黃湯出自清代醫家吳謙所著《醫宗金鑒》，以六味地黃丸為基礎方，合知母、黃柏而成，具有滋陰降火功效，是治療陰虛火旺的代表方，主治陰虛火旺而致骨蒸勞熱、虛煩盜汗、腰脊酸痛、遺精等證。王曄等^[6]運用知柏地黃湯聯合化療治療腎陰虛型前列腺癌患者80例，結果顯示，聯合治療組患者臨床癥狀顯著改善，精子質量提高。劉華等^[7]運用知柏地黃湯加減聯合內分泌治療晚期前列腺癌患者，經過3個月治療后，聯合治療組患者潮熱不適等不良感覺明顯改善。近年來，網絡藥理學的興起和發展為中藥現代化研究提供了新思路，本研究運用網絡藥理學方法，深入探討知柏地黃湯治療前列腺癌的潛在作用機制，為進一步研究知柏地黃湯治療前列腺癌的藥理機制提供依據，并為臨床應用提供參考。

1? 研究方法

1.1? 知柏地黃湯有效成分和作用靶點篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/uniprot/）獲取知柏地黃湯有效成分和作用靶點，設置篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18。

1.2? 前列腺癌相關靶點獲取

以關鍵詞“Prostate Cancer”在OMIM（https：// www.omim.org/）、CTD（https：//ctdbase.org/）數據庫檢索前列腺癌相關靶點，并通過查閱文獻進行補充，最后導入UniProt數據庫進行靶點名稱標準化處理，利用Venny 2.1在線工具篩選知柏地黃湯有效成分和前列腺癌的交集靶點，并繪制韋恩圖。

1.3? 藥物-有效成分-靶點-疾病網絡構建

將知柏地黃湯組成藥物、有效成分、交集靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，構建藥物-有效成分-靶點-疾病網絡。網絡中的節點表示藥物、有效成分、交集靶點及疾病，連線表示節點間的相互作用。

1.4? 蛋白相互作用網絡構建

將交集靶點導入String數據庫（https：//string-db.org/），選擇物種為“homo sapiens”（人源），最低相互作用閾值設為“highest confidence=0.9”，得到蛋白相互作用（PPI）網絡。

1.5? 知柏地黃湯治療前列腺癌關鍵靶點篩選

應用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網絡進行拓撲分析，計算PPI網絡整體的中介中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）和點度中心性（Degree Centrality，DC），選取BC、CC和DC均大于平均值的靶點為關鍵靶點，明確PPI網絡中的關鍵靶點。

1.6? 交集靶點富集分析

通過R語言將交集靶點轉換為entrez ID，并運行BiocManager、clusterProfiler等程序包進行數據處理，以P<0.05為條件獲得GO功能和KEGG通路富集分析氣泡圖。最后運用Perl語言將entrez ID轉換為原始基因靶點。根據功能分析和通路富集結果對知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機制進行預測。

1.7? 主要有效成分與核心靶點的分子對接

選取知柏地黃湯中5個主要有效成分（豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇）與3個關鍵靶點（TP53、ESR1和JUN）進行分子對接。從PDB數據庫（https：//www.rcsb.org）中下載靶點蛋白的3D結構，從TCMSP數據庫中下載有效成分的3D結構并保存為mol2格式。利用PYMOL軟件對靶點蛋白進行除水除配體，利用AutoDock 1.5.6軟件將有效成分及靶點蛋白的格式轉換為pdbqt格式，最后運行AutoDock Vina進行分子對接，使用PYMOL軟件對結果進行可視化。一般認為，有效成分和靶點的結合自由能<-5 kcal/mol表示具有較好的結合性。

2? 結果

2.1? 有效成分-疾病靶點篩選

篩選得到知柏地黃湯有效成分107個，作用靶點150個，前列腺癌靶點825個，知柏地黃湯作用靶點和前列腺癌交集靶點65個，韋恩圖見圖1。

2.2? 藥物-有效成分-靶點-疾病網絡

采用Cytoscape 3.7.1軟件構建藥物-有效成分-靶點-疾病網絡，見圖2。該網絡中共有157個節點，包括作用于交集靶點的有效成分83個，靶點65個，760條相互作用連線。對知柏地黃湯有效成分進一步分析，結果提示，知柏地黃湯治療前列腺癌的有效成分主要為生物堿類和甾醇類，其中度值排名前5位的有效成分為豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇。運用Cytoscape 3.7.1軟件對活性成分進一步分析，度值≥26的21個有效成分見表1。

2.3? PPI網絡

為研究各靶點的相互作用關系，將65個交集靶點進行PPI網絡分析。結果顯示52個靶點發生較強的相互作用，共產生148條相互作用連線，見圖3。

2.4? 關鍵靶點網絡

PPI網絡DC平均值為4.5，BC平均值為0.007，CC平均值為0.405，選取BC、CC、DC均大于平均值的靶點為關鍵靶點，共有關鍵靶點19個，關鍵靶點PPI網絡見圖4。主要包括JUN（轉錄因子AP-1）、TP53（腫瘤蛋白p53）、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、TNF（腫瘤壞死因子）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、ESR1（雌激素受體1）、EGFR（表皮生長因子受體）等。

2.5? GO功能富集分析

對65個交集靶點進行GO功能富集分析，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）及細胞組分（CC）。共獲得1668條GO功能富集條目（P<0.05），其中BP條目最多，共有1527個，主要集中在細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、對活性氧的反應（response to reactive oxygen species）、對氧化應激的反應（response to oxidative stress）和細胞對氧化應激的反應（cellular response to oxidative stress）。MF相關條目有102個，主要涉及血紅素結合（heme binding）、四吡咯結合（tetrapyrrole binding）和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）。CC相關條目有39個，主要涉及囊泡腔（vesicle lumen）、細胞膜筏（membrane raft）和細胞膜微區（membrane microdomain）等。見圖5～圖7。

2.6? KEGG通路富集分析

對65個交集靶點進行KEGG通路富集分析，共獲得134條通路（P<0.05）。主要涉及流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）等通路。見圖8。

2.7? 分子對接結果

知柏地黃湯主要有效成分與關鍵靶點的對接結果見表2，具體示意圖見圖9。結果表明，豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇與關鍵靶點TP53、ESR1、JUN具有較好的結合性。

3? 討論

本研究應用網絡藥理學方法對知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機制進行初步研究，系統揭示了知柏地黃湯治療前列腺癌的物質基礎和分子機制。其中豆甾醇、槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇在網絡中的度值較大，可能是治療前列腺癌的主要有效成分。研究發現，上述成分可抑制多種癌細胞增殖和誘導細胞凋亡，如肝癌細胞^[8-9]、胃癌細胞^[10-11]、前列腺癌細胞^[12]、結腸癌細胞^[13]、肺癌細胞^[14]、膠質瘤細胞^[15]及乳腺癌細胞^[16]等。

對知柏地黃湯與前列腺癌的交集靶點進行PPI映射，并構建關鍵靶點PPI網絡，關鍵靶點主要有JUN、TP53、MAPK1、TNF等，可能是知柏地黃湯治療前列腺癌的潛在靶點。TP53基因位于人類第17號染色體上，研究表明，超過50%的腫瘤患者存在TP53基因突變，腫瘤相關的突變型p53蛋白不僅失去抑制腫瘤的功能，并且在腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、耐藥性等方面發揮重要作用^[17]。張帥等^[18]研究發現，TP53高表達可能預示著原發性胃間質瘤患者術后具有更高的復發和轉移風險。費喜佳^[19]實驗表明，β-谷甾醇可調節TP53基因，加速腫瘤細胞凋亡。卞春安等^[20]分析了120例肺腺癌患者術后病理資料，并運用免疫組化法檢測患者組織標本中突變型p53蛋白的表達。結果顯示，TP53基因突變的肺腺癌患者預后較差，突變型p53蛋白可以作為預測患者預后的分子標志物。MAPK是細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細胞質和細胞核內，能將細胞外刺激信號傳導至細胞內及細胞核內，并引起細胞生物學行為，具有調節細胞增殖、分化、發育和凋亡的功能^[21]。MAPK通路的異常活化會導致細胞喪失分化和凋亡能力，引起細胞異常增殖、惡性轉化，在腫瘤耐藥的機制中發揮重要作用^[22-23]。車煥莉^[24]研究表明，疏肝益腎方能下調人表皮生長因子受體2基因表達，抑制MAPK通路，起到逆轉乳腺癌細胞耐藥的作用。小檗堿可通過調節活性氧相關信號通路JNK/p38 MAPK、蛋白激酶C和細胞外信號調節激酶（ERK）等，激活內源性線粒體凋亡通路，發揮誘導腫瘤細胞凋亡的作用^[25]。李倩等^[26]研究表明，紅景天苷可延緩人肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的生長速度，破壞腫瘤細胞結構，促進腫瘤細胞凋亡，其機制可能與抑制MAPK/ERK1/2信號通路有關。在本研究中，知柏地黃湯可能通過MAPK的3種亞型MAPK1、MAPK8和MAPK14發揮抑制前列腺癌的作用。

現有研究顯示，在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達^[27]，在結腸癌中EGFR的高表達影響結腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，EGFR可作為腫瘤早期診斷和預后的重要指標^[28-29]。蔣寒冰等^[30]研究發現，黃芩素可通過抑制癌癥相關的EGFR-STAT信號通路，靶向作用于TGF-β₁，逆轉胃癌上皮間質轉化。JUN在多種癌癥中差異表達且具有較強活性，在乳腺癌中活化的JUN可影響腫瘤血管的生長，促進乳腺癌的轉移^[31];在膀胱癌患者中，JUN低表達患者的預后遠優于高表達患者^[32]。雌激素受體主要有2個亞型，分別為雌激素受體α（ESR-α/ESR1）和雌激素受體β（ESR-β/ESR2）。研究發現ESR1與山柰酚相結合具有很好的抗腫瘤作用^[33]。TNF是腫瘤微環境中最重要的炎性細胞因子之一，其中以TNF-α最具代表性，主要介導炎癥反應。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成，減輕炎癥反應，改善腫瘤微環境，促進腫瘤細胞凋亡^[34]。

綜上所述，知柏地黃湯可能通過作用于JUN、TP53、MAPK1等靶點發揮治療前列腺癌的作用。本研究尚存在不足之處，檢索的數據庫不能完全包括知柏地黃湯所有的化學成分及其相應的靶點，計算化學生物學方法本身也具有一定的局限性，且預測結果還有待后期的實驗加以驗證。

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（收稿日期：2021-04-12）

（修回日期：2021-05-08;編輯：鄭宏）