急性腦梗死患者外周血MIF、TLR4水平與腦水腫嚴(yán)重程度的相關(guān)性

宋士更, 韓瑞麗, 王一旻

天津市泰達(dá)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(天津 300457)

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)是神經(jīng)內(nèi)科常見病和多發(fā)病，具有高致殘率和病死率。ACI患者早期致死的主要原因是腦水腫[1]，其中炎癥反應(yīng)及炎癥因子在腦水腫形成的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前有許多評(píng)價(jià)腦水腫的方法和指標(biāo)，但基本都存在無法及時(shí)測(cè)定或使用條件有限的缺陷。因此尋找一種快速、靈敏的指標(biāo)來評(píng)價(jià)腦水腫嚴(yán)重程度顯得至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)由T細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制巨噬細(xì)胞自由移動(dòng)[3-4]。相關(guān)研究表明，腦組織中MIF等炎性細(xì)胞因子含量的變化對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后腦水腫的發(fā)生具有一定作用[5]。Toll樣受體4(toll-like receptors，TLR4)是TLR家族中的一員，與非特異性免疫及炎癥反應(yīng)有密切聯(lián)系。研究結(jié)果表明，TLR4參與并介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷過程，通過抑制TLR4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可改善腦水腫情況[6]。但目前探討ACI患者外周血MIF、TLR4水平與腦水腫嚴(yán)重程度相關(guān)性的研究較少。因此，本研究通過檢測(cè)ACI患者外周血中MIF、TLR4水平，監(jiān)測(cè)患者患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值，探討ACI患者外周血MIF、TLR4水平與腦水腫嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為臨床上治療ACI提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2019年2月于本院住院治療的165例ACI患者為研究對(duì)象，采用1.5T MRI unit(GE SIANA EX-CITE Ⅱ，USA)對(duì)患者進(jìn)行頭顱MRI檢查，其中檢查序列有T1WI、DWI、T2WI。應(yīng)用開放源圖像處理軟件OsiriX中感興趣區(qū)分割功能進(jìn)行結(jié)果處理，經(jīng)軟件自動(dòng)計(jì)算獲得腦梗死體積，其中小面積腦梗死(小面積ACI組)(最大直徑<1.5 cm)86例，年齡42～83歲，平均(62.96±8.43)歲；男39例，女47例。大面積腦梗死(大面積ACI組)(最大直徑≥5 cm)79例，年齡43～85歲，平均(64.23±8.64)歲；男42例，女37例。同期選取72例健康體檢者作為對(duì)照(對(duì)照組)，年齡41～83歲，平均(62.54±9.57)歲；男34例，女39例。3組之間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合腦梗死和腦出血中西醫(yī)結(jié)合診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]并經(jīng)CT或MRI證實(shí)；(2)發(fā)病前4周內(nèi)無任何創(chuàng)傷或外科手術(shù)史；(3)首次發(fā)病，發(fā)病后24 h內(nèi)未經(jīng)任何治療入院；(4)入院病程超過8 d，且住院期間無任何并發(fā)感染。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有明顯心肝腎功能不全者；(2)有急慢性炎癥、自身免疫性疾病、糖尿病者；(3)患有惡性腫瘤者；(4)入院前4周內(nèi)服用過免疫抑制劑、炎癥抑制藥及激素等藥物者。

本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本研究中所有患者均由主治以上醫(yī)師診斷，所有受試對(duì)象及家屬均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究?jī)?nèi)容并自愿參加，同時(shí)簽署知情同意書。

查閱門診及住院病歷，收集了解患者及對(duì)照組入院前一般資料，包括性別、年齡、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)評(píng)分、血壓、血脂、吸煙、飲酒等。

1.2 主要試劑與儀器 MIF ELISA試劑盒(貨號(hào)：YM-QP11186)，購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：dp419)，購(gòu)自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix(貨號(hào)：Q111-02)，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；miScript SYBR? Green qPCR Kit(貨號(hào)：218076)，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。CFX384實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BORN-BE無創(chuàng)腦水腫動(dòng)態(tài)監(jiān)護(hù)儀，購(gòu)自重慶博恩富克醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 入選研究對(duì)象于發(fā)病后第1、3、5、7天清晨抽取空腹外周靜脈血樣，對(duì)照組于清晨抽取空腹外周靜脈血樣，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測(cè)。

1.3.2 外周血中MIF水平測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)3組外周血中MIF水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 外周血中TLR4水平測(cè)定 采用qRT-PCR法檢測(cè)3組外周血中TLR4水平。采用RNA提取試劑盒提取外周血中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對(duì)TLR4進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：miScript SYBR? Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃、45 s，54.9℃、45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。TLR4及內(nèi)參β-actin的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對(duì)外周血TLR4表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值測(cè)定 所有患者均于入院后采用BORN-BE無創(chuàng)腦水腫動(dòng)態(tài)監(jiān)護(hù)儀測(cè)定患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值。每天監(jiān)測(cè)兩次，每次25 min，共7 d，腦水腫指數(shù)每天取兩次的平均值。操作步驟嚴(yán)格按照儀器操作指南進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組之間性別、年齡、血壓、血脂、吸煙、飲酒等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大面積ACI組NIHSS評(píng)分顯著高于小面積ACI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組患者一般資料比較

2.2 3組外周血中MIF、TLR4水平比較 第1、3、5、7天時(shí)，大面積ACI組外周血中MIF、TLR4水平顯著高于小面積ACI組和對(duì)照組(P<0.05)；小面積ACI組MIF水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；第3、5天時(shí)，小面積ACI組外周血中TLR4水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 3組外周血中MIF、TLR4水平比較

2.3 3組患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值比較 第1、3、5、7天時(shí)，大面積ACI組擾動(dòng)系數(shù)均顯著高于小面積ACI組(P<0.05)。見表4。

表4 3組患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值比較

2.4 MIF與CEI擾動(dòng)系數(shù)值相關(guān)性 小面積ACI組、大面積ACI組在第1、3、5、7天時(shí)外周血中MIF與患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 MIF與CEI擾動(dòng)系數(shù)值相關(guān)性

2.5 TLR4與CEI擾動(dòng)系數(shù)值相關(guān)性 小面積ACI組、大面積ACI組在第1、3、5、7天時(shí)外周血中TLR4與患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6。

表6 TLR4與CEI擾動(dòng)系數(shù)值相關(guān)性

3 討論

ACI是臨床常見的缺血性腦血管疾病，是早期腦組織發(fā)生缺血、缺氧及壞死而引起的腦卒中[8-9]。

ACI患者發(fā)生腦水腫，會(huì)使水分異常積留于腦組織內(nèi)，造成神經(jīng)功能缺損，顱內(nèi)壓上升，進(jìn)而加重患者病情，甚至危及患者生命，為家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[10]。因此準(zhǔn)確及時(shí)地評(píng)價(jià)腦水腫嚴(yán)重程度、及時(shí)采取合理有效的治療措施，對(duì)降低腦水腫的發(fā)生率對(duì)ACI患者具有重要意義。

MIF是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在體內(nèi)廣泛分布，且有多種功能，能作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素和垂體激素，從而影響腦水腫發(fā)生過程中的炎性反應(yīng)[11]。TLR4是一種在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)分子，主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞，在腦缺血、腦出血后腦水腫形成的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[12]。MIF、TLR4參與各類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用，與ACI患者發(fā)生腦水腫有密切聯(lián)系。原鐵等[13]通過觀察檢測(cè)藥物對(duì)腦出血大鼠TLR4表達(dá)的影響，探討神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制，最終證明天麻鉤藤飲通過抑制TLR4表達(dá)來保護(hù)神經(jīng)功能并減輕腦水腫，進(jìn)一步證明TLR4水平與腦水腫密切相關(guān)。腦水腫監(jiān)護(hù)的主要技術(shù)參數(shù)為電阻抗擾動(dòng)系數(shù)，正常人擾動(dòng)系數(shù)值一般在7左右，升高時(shí)表示腦水腫形成。本研究結(jié)果顯示，ACI患者電阻擾動(dòng)系數(shù)值早期逐漸升高，到第5天達(dá)到高峰值，第7天開始逐步降低，反映了腦梗死患者腦水腫的形成過程。除此之外，研究結(jié)果顯示在第1、3、5、7天時(shí)，大面積ACI組擾動(dòng)系數(shù)均顯著高于小面積ACI組，提示腦梗死體積越大，患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值越大，腦水腫也越嚴(yán)重。ACI患者外周血中MIF、TLR4水平變化與患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值的波動(dòng)一致，且小面積ACI組、大面積ACI組在第1、3、5、7天時(shí)外周血中MIF、TLR4與患側(cè)CEI擾動(dòng)系數(shù)值均呈正相關(guān)，即兩者水平與腦水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。分析MIF、TLR4誘發(fā)腦水腫可能的作用機(jī)制為：損傷了患者血-腦屏障，使其通透性增加，從而引發(fā)腦水腫；激活補(bǔ)體進(jìn)而產(chǎn)生大量組胺，引發(fā)血管通透性增加，同時(shí)促使鈣離子向細(xì)胞內(nèi)彌散，進(jìn)而引發(fā)腦水腫。提示MIF、TLR4可作為診斷ACI患者腦水腫早期嚴(yán)重程度的輔助性指標(biāo)，臨床上可通過密切監(jiān)測(cè)外周血中MIF、TLR4水平變化，及時(shí)采取合理、有效的治療措施，降低腦水腫發(fā)病率及患者病死率外周血中MIF、TLR4。

在本研究一般資料中，3組之間性別、年齡、血壓、血脂、吸煙、飲酒等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大面積ACI組NIHSS評(píng)分顯著高于小面積ACI組。NIHSS評(píng)分是一種臨床上評(píng)價(jià)ACI患者神經(jīng)功能缺損的量表，是臨床診治及評(píng)估ACI的重要評(píng)分依據(jù)[14]。本研究中表明NIHSS評(píng)分隨腦梗死體積增大而升高，提示隨腦梗死體積增大，患者神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重。

綜上所述，ACI患者外周血MIF、TLR4水平與腦水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，MIF、TLR4水平的變化對(duì)腦水腫的病情發(fā)展有重要意義。臨床上應(yīng)密切監(jiān)測(cè)ACI患者M(jìn)IF、TLR4水平的變化，采取合理有效的治療措施，降低ACI患者病死率。但本研究為回顧性研究，樣本資料的準(zhǔn)確性和完整性受記錄水平影響，且MIF、TLR4影響腦水腫的具體作用機(jī)制有待深入研究。