應用隸屬函數法評價10個紫花苜蓿品種的耐熱性

楊雨薇，王琳,盧俊峰，任翔，徐鑫，劉大林

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學農業科技發展研究院(國際聯合實驗室)，江蘇 揚州 225009)

隨著全球氣候變暖的不斷加劇，植物正面臨著高溫脅迫的危害。高溫脅迫對植物生長造成的直接傷害表現為植物光合速率降低后葉片出現萎蔫、失綠的現象，與此同時，植物呼吸速率下降，體內的部分有害物質無法被清除或降解。部分植物的根部在高溫逆境下會出現褐變，根系生物量的積累受到抑制從而加速植物的死亡。植物細胞膜是抵抗高熱脅迫的重要組織，高溫脅迫下植物體內的活性氧分子發生氧化反應形成丙二醛，并在植物體內積累對細胞質膜造成損傷。此外，植物在受到高溫脅迫后蛋白質合成受阻，酶活性下降，造成植物體內代謝失調。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為一種常見的多年生豆科牧草，在我國北方地區草地面積較大的區域種植。除此之外，在南方紫花苜蓿的種植已經有了一定的規模并且發展前景良好，但其適宜生長的日平均氣溫為15～21℃，對高溫極其敏感[1]。我國長江中下游地區常年高溫，夏季最高溫度可達40℃，對農作物的生產造成諸多不利的影響。紫花苜蓿在南方地區種植還會面臨高溫多濕帶來的病蟲害問題。因此高溫脅迫是限制南方地區紫花苜蓿生長的一個重要因素。張鶴山等[2]測量了19個紫花苜蓿品種的耐熱性，發現WL系列品種的耐熱性較強，劉大林等[3]對高溫脅迫下紫花苜蓿的部分生理生化指標做了分析，李德峰[4]分析了夏季苜蓿減產的原因，任翔等[5]通過施加硅酸鉀緩解了紫花苜蓿對高溫環境的不良應答反應。雖然國內眾多學者對紫花苜蓿的耐高溫能力進行了生長和生理方面指標測定，但是使用不同指標對紫花苜蓿耐熱性進行隸屬函數綜合分析較少。本研究以10個紫花苜蓿品種作為試驗材料，通過人工氣候培養箱模擬高溫環境，探究高溫脅迫對紫花苜蓿幼苗生長和生理的影響，并對10個紫花苜蓿品種的耐高溫能力進行綜合評價，以期為我國多高溫天氣的地區或夏季持續高溫地區紫花苜蓿的種植提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取揚州大學動物科學與技術學院草業科學實驗室中的10個紫花苜蓿品種作為試驗材料，其特性及編號見表1。

表1 紫花苜蓿材料特征及編號

1.2 試驗設計

采用盆栽法進行栽培試驗，花盆直徑為30 cm，高35 cm，每盆裝過篩(孔徑0.5 mm)風干土900 g。選取籽粒飽滿、大小一致的10個紫花苜蓿品種種子，于5%次氯酸鈉溶液中浸種消毒15 min。每個品種10盆，每盆播種40粒，播深2 cm。播種21 d后，分別挑選每個品種長勢相對一致的6盆植株作為處理材料，其中3盆室溫下放置為對照組，其余3盆放入人工氣候培養箱中，在38℃光照處理14 h，35℃黑暗處理10 h的模式下進行高溫脅迫處理。每個處理均3次重復。高溫脅迫處理14 d后對所有材料進行采樣，分別測其各項生長和生理指標。

1.3 測量指標與方法

1.3.1 生長指標的測定 將經過14 d處理后的紫花苜蓿植株放入蒸餾水中，將根部清洗干凈，用吸水紙吸干水分，每盆隨機取10株紫花苜蓿，用剪刀迅速將紫花苜蓿的根、莖、葉分開，用直尺(精度0.1 cm)分別測其地上和地下部分絕對長度，并取平均值；稱量其各部位鮮重，在105℃殺青烘干之后，分別測量根、莖、葉的干重。

1.3.2 葉綠素含量的測定 參考施海濤[6]葉綠素測定方法測定葉綠素含量，稍有改動。在高溫脅迫處理下生長14 d后，稱取紫花苜蓿的新鮮葉片0.1 g，記為m，將稱取的新鮮葉片放入10 mL的離心管中，隨后在離心管中加入5 mL 95%的乙醇，用錫箔紙包嚴后黑暗條件下浸提48 h，然后以95%的乙醇作為空白對照，用分光光度計測波長665和649 nm下的吸光度。然后根據下列方程式計算葉綠素a含量、葉綠b含量和葉綠素總含量。

Chla(mg/g FW)=(13.95×D665 nm-6.88×D649 nm)×0.005/m

Chlb(mg/g FW)=(24.96×D649 nm-7.32×D665 nm)×0.005/m

Chl(mg/g FW)=Chla+Chlb=(18.08×D649 nm+6.63×D665 nm)×0.005/m

式中：Chla為葉綠素a的含量，Chlb為葉綠素b的含量，Chl為葉綠素的總含量。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測量[6]。

1.3.4 可溶性糖含量的測定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[6]。

1.4 抑制率分析

本研究在綜合評價時根據對照處理和高溫處理下10個紫花苜蓿品種各單項指標均值，計算高溫脅迫下10個紫花苜蓿品種的各單項指標的抑制率。 計算公式為：

a% = (1-W/CK)×100%

式中：a% 表示單項指標的抑制率，CK表示對照處理下該單項指標的均值，W表示高溫處理下該單項指標的均值。

1.5 耐高溫性綜合評價

用隸屬函數評價方法[7-8]，對各紫花苜蓿品種的耐熱性進行綜合評價。計算公式如下：

F1(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

F2(Xi)= 1 -(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：X表示第i個指標值，Xmin表示第i個指標的最小值，Xmax表示第i個指標的最大值。若該指標與紫花苜蓿的耐高溫能力呈相反關系，則采用用反隸屬函數公式F2計算其隸屬函數值。

1.6 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件 對數據進行單因素方差分析。在0.05置信水平上用Duncan法進行多重比較，用Excel 2010作圖，SPSS 19.0 進行Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種幼苗生長的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個紫花苜蓿品種的株高、根長、總生物量、根干重、莖干重和葉干重均低于對照處理(表2)，表明紫花苜蓿對于高溫較為敏感并且紫花苜蓿的生長在高溫條件下受到了脅迫。高溫脅迫下，其葉片鮮重顯著低于對照(P<0.05)，表明高溫脅迫對紫花苜蓿葉片生長有抑制作用。MS10品種的莖鮮重在處理組與對照組也有顯著性差異(P<0.05)，表明高溫脅迫對植物莖的生長也有影響。

表2 高溫脅迫下紫花苜蓿的生長特性

2.2 高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種幼苗葉綠素含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個紫花苜蓿品種葉片中的葉綠素a含量均低于對照組，除MS3、MS8和MS9 3個品種在高溫脅迫下與對照組無顯著差異(P>0.05)，其余7個紫花苜蓿品種在高溫脅迫下的葉綠素含量與對照組的葉綠素含量均有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。此外，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素b含量也均顯著低于對照組(P<0.05)，MS1-MS10分別下降58.90%、42.30%、25.50%、11.90%、35.80%、30.50%、82.60%、28.10%、6.10%和5.80%。與對照組相比，MS1-MS10高溫脅迫下葉綠素總含量分別下降24.40%、32.60%、10.00%、15.80%、17.80%、10.40%、24.90%、8.70%、3.50%和5.00%。除了MS9和MS10與對照組無顯著差異，其他品種的葉綠素總量均顯著低于對照(P<0.05)。

圖1 不同處理下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量Fig.1 Impact of different treatments on chlorophyll content of alfalfa leaves注：不同小寫字母表示同一紫花苜蓿品種在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種幼苗MDA含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量均顯著高于對照組(P<0.05)，MS1-MS10較對照組分別上升4.50%、39.20%、5.50%、16.40%、24.60%、18.80%、34.30%、33.10%、7.50%和62.90%，MS10和MS2品種上升幅度較大(圖2)。

圖2 不同處理下紫花苜蓿葉片中的MDA含量Fig.2 Effect of different treatments on MDA content of alfalfa leaves

2.4 高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種幼苗可溶性糖含量的影響

高溫脅迫下，10個紫花苜蓿品種幼苗葉片中的可溶性糖含量均高于對照組。高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量與對照組具有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。高溫脅迫下，MS1-MS10可溶性糖含量較對照組分別上升72.50%、10.70%、4.90%、19.20%、12.40%、7.50%、27.75%、13.20%、28.00%和19.90%。

圖3 不同處理下紫花苜蓿葉片中的可溶性糖含量Fig.3 Effects of temperature treatments on the content of soluble sugar in alfalfa leaves

2.5 高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種抑制率的影響

2.5.1 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項指標的抑制率 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項指標的抑制率如表3所示。

表3 高溫脅迫下10個紫花苜蓿品種各項指標的抑制率

2.5.2 各項指標抑制率間的Pearson相關性分析 株高與莖鮮重呈顯著正相關，與葉綠素b含量極顯著負相關(表4)。根長與MDA含量呈顯著負相關。根鮮重與葉鮮重呈顯著正相關。葉鮮重與可溶性糖含量

表4 高溫脅迫下紫花苜蓿各項指標抑制率間的Pearson相關性分析

顯著負相關。葉綠素b含量與葉綠素總含量呈現極顯著正相關。

2.5.3 紫花苜蓿耐熱性評價 在利用隸屬函數對10個紫花苜蓿品種的耐熱性進行評價時，根據葉綠素的抑制率與紫花苜蓿的耐高溫能力呈反比例關系采用反隸屬函數公式計算葉綠素含量的隸屬函數值；可溶性糖含量和MDA含量與紫花苜蓿的高溫敏感性呈正比例關系，所以用隸屬函數公式計算其隸屬函數值。結果表明，MS3品種的隸屬函數值最高，均值為0.84，MS8和MS6次之，均值分別為0.64、0.57。MS10的隸屬函數值均值僅為0.36，為各品種中最低；MS1和MS2的隸屬函數值也僅為0.41和0.38，處于較低的水平(表5)。高溫脅迫下紫花苜蓿MS3、MS6和MS8屬于對高溫耐受力較強的材料，而紫花苜蓿MS1、MS2和MS10則是對高溫相對較敏感型材料。

表5 高溫脅迫下10個品種紫花苜蓿隸屬函數分析

3 討論

對不同紫花苜蓿品種進行耐熱性評價有助于進一步探究高溫對紫花苜蓿生長和生理的影響和培育耐高溫的紫花苜蓿品種。由于長江中下游地區夏季高溫天氣溫度維持在38℃左右，所以本研究采用培養箱模擬38℃高溫環境，探究了高溫脅迫對10個紫花苜蓿品種生長和生理特性的影響，通過隸屬函數分析進行耐熱性綜合評價。

根系是植物生長發育過程中獲取水分和養分關鍵的部位，根系的健康狀況對植物水分和養分的吸收具有重要影響[9]。本研究發現，高溫脅迫下10個紫花苜蓿品種的根長和根重均低于對照組(表2)。據報道，在高溫下植株的生長狀態普遍表現為生長緩慢、枯萎甚至在較高的溫度下部分植株也會發生死亡的現象[3]。在夏季最高溫度超過35℃的地區，紫花苜蓿越夏時有死亡現象，研究表明溫度越高、脅迫時間越長植物生長狀態越差[10-11]，且高溫后恢復生長的時間較為緩慢[12-13]，本研究結果與之一致。此外，本研究中紫花苜蓿植株不同部位的生物量對高溫脅迫的響應存在差異。本研究認為根系的健康狀況將直接影響莖和葉部的水分、養分吸收，根系越健康則植株也越健康，抵抗逆境的能力也就越強。

葉綠素是植物進行光合作用的重要色素。本研究結果顯示，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素含量均低于對照組(圖1)。楊秋珍等[14]發現高溫脅迫下的甜瓜葉片葉綠素含量呈下降的趨勢，且隨著脅迫時間的延長下降的幅度增大，本實驗與其結果相一致，宰學明等[15]研究表明在高溫42℃處理過程中，花生幼苗的葉綠素含量隨著處理時間的延長而下降，表現為初期下降幅度平緩，后期變化明顯。任翔等[5]研究表明高溫可引起葉綠素分解，導致葉片衰老，高溫使得紫花苜蓿發生明顯的光抑制作用。其原因可能是高溫脅迫促使ROS形成[16]，破壞ROS和抗氧化體系代謝之間的動態平衡，而葉綠體作為ROS的主要生成位點容易被氧化劑攻擊[17-18]。葉綠素合成受限和自由基對葉綠素的誘導使高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量降低[18-19]。

生理響應是植物對逆境脅迫響應的重要內在體現。本研究發現高溫脅迫處理14 d后10個紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量顯著高于對照(圖2)，該結果與劉大林等[3]對高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中MDA含量變化的規律一樣。其原因可能是長期高溫情況下脂類形成了囊泡，從而破壞了膜結構，使膜失去了選擇透性和主動吸收能力。此外，高溫破壞了細胞內活性氧產生與清除之間的平衡，使得氧化物在細胞膜內大量積累。MDA含量是衡量脂膜過氧化程度的重要指標，紫花苜蓿葉片的細胞膜結構遭到破壞，細胞的半透性失效使得細胞膜中物質滲透出來。在高溫脅迫下，MDA在植物體內的積累導致蛋白質的交聯和聚合，影響細胞膜的流動性，從而對植物的正常生長造成直接傷害[20-21]。

可溶性糖作為滲透調節物質,當植物受到非生物因子脅迫時,滲透調節物質的含量會增加以提高細胞液的滲透壓,提高細胞保水能力及從外環境的吸水能力,從而防止植物脫水,緩解脅迫對膜系統的損害,保護和調節植物正常生長[22]。本次研究發現，高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量均高于對照組(圖3)，結果與劉大林等[3]的研究相一致。趙壯軍等[23]通過對高羊茅初級代謝產物的分析發現，根系中的有機酸和脂肪酸含量較多，而氨基酸、糖類以糖醇普遍積累在植株葉片中。紫花苜蓿可能通過利用糖醇和肌醇的抗氧化能力來更好地適應高溫逆境。紫花苜蓿可以將淀粉轉化為可溶性糖或通過光合作用直接合成高濃度的可溶性糖來維持紫花苜蓿的呼吸作用[24-25]，從而出現可溶性糖升高的結果。

本研究中株高、根長、根莖葉干鮮重、葉綠素含量、MDA含量、可溶性糖含量等生長、生理指標在高溫脅迫前后的變化特征表明，紫花苜蓿不同品種之間不能通過單一的指標來準確判斷其耐熱性的強弱，必須對多個生理指標進行綜合分析與評價。近年來，隸屬函數值法被廣泛應用于植物的抗逆性評價[26]，該方法已在黃瓜[27]，香菇[28]，大白菜[29]，杜鵑[30]等作物上應用，效果良好。隸屬函數法作為耐熱性評價的常用方法，所用的指標可分為3種：1)用發芽率、發芽勢、發芽指數、抗旱指數等來評價；2)用各指標的隸屬函數值累加求平均來評價；3)用各指標的相對值來評價[27-29]。在10個品種中，WL-712系列雖然其秋眠級較高，但是通過隸屬函數值分析其耐熱性較差，說明秋眠級高低與耐熱性強弱并無必然聯系。本研究采用生長、生理等13個指標，計算各指標的隸屬函數值并累加求平均值來評價10個紫花苜蓿品種的耐熱性，其耐熱性強弱依次為：WL-319HQ>WL65HQ>WL-354>WL-903>WL-168>愛菲>WL-363>三德利>維多利亞>WL-712。

4 結論

高溫脅迫對不同紫花苜蓿品種幼苗生長和生理特性具有一定的影響。具體表現為，高溫處理14 d后的各項生長指標均低于對照組；葉綠素含量降低；細胞內MDA含量顯著上升；可溶性糖含量上升。耐熱性綜合評價表明，紫花苜蓿WL-319HQ，WL-656HQ和WL-354是高溫耐受型品種， WL-712,三德利和維多利亞是高溫敏感型品種。