黑麥草品種對灰梨孢灰斑病的室內抗性評價

陳虹，周俗，劉剛，王鈺，康曉慧

(1.四川省草原科學研究院，青藏高原高寒草地生態修復工程技術研究中心，四川 成都 611731；2.西南科技大學，四川 綿陽 621000)

我國黑麥草種植面積大，以南方種植更為普遍[1]。黑麥草屬于禾本科黑麥屬(Lolium)，多年生或一年生草本植物，耐寒性較強，生長發育速度快，品質優良，在輪作系統中，黑麥草常與青貯玉米進行輪作。在秋冬季種植黑麥草，不僅能夠減少土地資源的浪費，還能在冬春季節為畜牧業提供優質的青綠飼草，解決冬季畜牧業缺少青綠飼料和冬季田地荒廢的問題，進而提高農牧民的收益，促進畜牧業的發展[2]。黑麥草真菌性病害病原菌主要有銹菌(Pucciniastriiformis)、鐮刀菌(Fusariumpoae)、禾草離孺孢(Bipolarissorokiniana)和灰梨孢(Pyriculariagrisea)等[3-7]，該病害常常會造成黑麥草減產并影響黑麥草營養品質?；依骀咴斐傻幕野卟∈軠囟群蜐穸扔绊懽畲?，高溫高濕，雨、霧、露存在的天氣均有利于發病。氣溫在20～30℃，陰雨天多，相對濕度保持在90%以上，容易引起該病嚴重發生。黑麥草感病初期，葉片呈水浸狀的微傷,而后變成壞死狀斑點，并且葉片上的斑點會迅速擴大，發展成灰褐色、紡錘形病斑。病斑中部灰色或灰褐色，邊緣紫褐色，病斑周圍一圈呈黃色枯萎狀[8-14]。調查發現，黑麥草灰梨孢灰斑病在四川發生較為普遍，嚴重時導致黑麥草整株枯萎死亡。薛福祥[8]、張家齊等[9]研究表明，黑麥草在高溫高濕條件下，可導致90%以上植株死亡，而國內外灰梨孢灰斑病相關文獻較少，對于不同品種的黑麥草種質評價方面的研究不多。本研究通過研究盆栽條件下接種灰梨孢灰斑病菌[15]后的發病情況，分析四川主要栽培的黑麥草不同品種的抗病性并進行評價[16-18]，為選育抗病品種及綠色防控提供依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

病葉采集：2018年10月于成都市大邑縣韓場鎮采集處于分蘗期的黑麥草灰梨孢灰斑病病葉，裝入密封袋編號保存。

試驗采用塑料花盆(底部開孔，盆底直徑175 mm，盆口直徑235 mm，盆高200 mm)，盆栽用土為通用型有機營養土(已經過高溫殺菌)。

供試黑麥草品種中多年生黑麥草(Loliumperenne)4個品種，分別為維多利亞、紳士、首相、紐怡；一年生黑麥草(Loliummultiflorum)6個品種，分別為安第斯、長江2號、杰威、普通、安格斯1號、川農1號。播種前進行發芽率測試，10個品種種子質量符合試驗要求，詳見表1。

表1 參試品種及來源

1.2 試驗設計

1.2.1 病原菌制備 根據柯赫氏法則，分離純化采集到的疑似黑麥草灰梨孢灰斑病病葉上的病原物，鑒定病原菌為灰梨孢灰斑病菌。將得到的病原菌接種至正常黑麥草植株上，發病后表現出同樣的水漬狀病斑，將發病葉片重新分離獲得與之前接種一致的病原菌。將純化后的灰梨孢灰斑病病原菌保存于-4℃低溫培養箱中備用。

1.2.2 土壤最大持水量測定 將裝有滅菌土壤(每個塑料盆裝取滅菌土壤2 500 g)的花盆放置于托盤中，反復均勻地向花盆中澆水，直至花盆底部流出的水與托盤口同高。然后將花盆口用塑料薄膜封住，共設置3個重復。放置24 h后，將花盆從托盤中取出，擦去花盆表面的水分后稱重，得到總重(W1)。再將花盆放置于80℃烘箱中烘干24 h，反復稱量至重量不再變化時記錄干重(W2)。根據公式W=W1-W2計算土壤最大持水量，本試驗中每盆土壤平均最大持水量為980 g。

1.2.3 盆栽植苗 參照《一年生黑麥草主要病害綠色防控技術規程DB51/T 2452-2018》和《多年生黑麥草牧草生產技術規程DB51/T 399-2004》，將黑麥草種子均勻撒播在準備好的塑料花盆里，設置接菌和不接菌處理，接菌處理設置3個重復，共設置盆栽(3+1)×10個。待黑麥草種子萌發一周后，將每盆黑麥草處理至株數均勻、間距合理，每盆黑麥草數量大約為50株，整個培養期間保持無雜草生長，調節土壤中含水量為土壤最大持水量的70%。

1.2.4 接種方法 9月22日下種，黑麥草植株自然生長至第5周(10月28日)開始接菌。接菌采用孢子懸浮液涂抹法，將灰梨孢灰斑病菌用PDA培養基密封培養3周，刮下孢子制成孢子懸浮液，用紗布涂抹于葉片表面。之后，將透明塑料薄膜覆蓋于盆栽上1周，從接種灰梨孢灰斑病病菌開始，測定記錄環境中溫濕度(USB型溫濕記錄儀，型號為Cos-3)，控制接菌后1周內的相對濕度為75%以上。每天定期觀察、澆水，保持盆栽內環境濕度(圖1)。

圖1 盆栽環境Fig.1 The environment of pot cultivation

1.2.5 發病情況調查 接菌后出現病情即開始調查，此后每3天調查一次，共調查4次。每盆隨機抽取10株，記錄發病株數和嚴重度，計算發病率、平均嚴重度和病情指數，計算公式如下：

發病率=[病株(器官、葉)數/調查總株(器官、葉)數]×100%

平均嚴重度=[∑(分級數值×病葉數)/總病葉數)]×100%

病情指數=發病率×平均嚴重度×100

1.2.6 病情分級 采用病級分類和系統聚類分析方法對黑麥草進行抗病性評價，參照南志標[17]、陳秀蓉[18](2003)的標準對其嚴重度進行分級。0級，無癥狀；1級，病斑面積≤5%；2級，病斑面積6%～20%；3 級，病斑面積21%～40%；4級，病斑面積41%～70%；5級，病斑面積≥71%。待獲得若干樣本的嚴重度數值后，采用加權平均法計算出平均嚴重度。

參照文克儉[19]的標準，根據各品種病情指數對其抗病性進行分級。抗性評價分為4級：高抗(HR)：病情指數為0～5；中抗(MR)：病情指數為5.01～25；中感(MS)：病情指數為25.01～40；高感(HS)：病情指數為40.01～100。

1.2.7 數據處理 用EXCEL 2016對發病率、平均嚴重度和病情指數數據進行系統處理，用SPSS 25.0對黑麥草灰梨孢灰斑病病情指數數據進行方差分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯(Duncan)法多重比較檢驗各處理間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 發病過程

接種病原菌后，環境溫度最高為33.2℃，最低為12℃，并且前3 d變化較為明顯，之后趨于緩和(圖2)。接種環境相對濕度滿足病原菌萌發條件，從第3 d起，一年生黑麥草安第斯、普通、安格斯1號、川農1號出現葉部病斑，發病率均為10%以上，而長江2號、杰威未出現病斑；多年生黑麥草首相、維多利亞、紳士、紐怡發病率僅為1%。一年生黑麥草安第斯、普通、安格斯1號、川農1號病斑面積迅速擴大，全株染病。發病后期，川農1號、安格斯1號和安第斯受灰梨孢灰斑病影響導致整株枯萎狀死亡(圖3)。

圖2 盆栽外環境溫度Fig.2 Ambient temperatures for plant growth

圖3 植株受侵染后枯萎狀死亡Fig.3 The plants withered and died after being infected注：圖為品種安格斯(a)和普通(b)

2.2 病原菌鑒定

對接種的灰梨孢灰斑病進行病原菌分離純化后，挑取部分菌絲于顯微鏡下觀察鑒定，分生孢子梗單生或叢生，多不分枝，頂部屈膝，淡褐色，表面光滑，(60～200) μm×(3.5～5.5) μm；產孢細胞多芽生，圓柱狀，合壁芽生產孢，合軸式延伸；分生孢子單生，洋梨形，無色至灰綠色，兩個隔膜，成熟時(21～31.5) μm×(7～10.5) μm，根據形態學特征確定其為灰梨孢灰斑病菌(圖4)。

圖4 灰梨孢灰斑病病原菌分離鑒定Fig.4 Isolation and identification of Pyricularia grisea注：a：病斑；b：菌落；c：菌絲及孢子

2.3 發病率

接種后，10個黑麥草品種先后出現不同程度的發病。發病初期(接菌后第6 d)，一年生黑麥草川農1號、安格斯1號、普通、安第斯發病率最為嚴重，顯著(P<0.05)高于其他黑麥草品種。多年生品種發病率較輕，其中，首相黑麥草發病率最輕，為11.7%。隨調查次數增加，每個品種的發病率均不斷增加，而川農1號的發病率一直維持在較高水平。接菌后15 d時，川農1號發病率最高，顯著高于其他品種黑麥草(P<0.05)。總體來看，多花黑麥草整體發病率較高，平均發病率為81.4%，從高到低依次是川農1號96.7%>安格斯1號88.3%>安第斯86.7%>普通78.3%>長江2號71.7%>杰威66.7%；多年生黑麥草(維多利亞、紳士、首相、紐怡)整體發病率較低，平均發病率為24.6%，最高不超過30%(表2)。

表2 黑麥草品種發病率

2.4 嚴重度

通過對接菌后的黑麥草發病面積調查，可以得出，10個黑麥草品種發病初期的平均嚴重度均不高，但一年生黑麥草病情平均嚴重度較多年生黑麥草大(表3)。

表3 黑麥草品種對灰梨孢灰斑病的平均嚴重度分析

一年生黑麥草中，安格斯1號各階段平均嚴重度一直處于最高水平；多年生黑麥草整體病情嚴重度較低，各階段平均嚴重度均顯著(P<0.05)低于一年生黑麥草。綜合來看，一年生黑麥草安格斯1號、安第斯、川農1號3個品種平均嚴重度無顯著差異(P<0.05)，但顯著(P<0.05)高于其他一年生黑麥草。從嚴重度級別來看，一年生黑麥草品種級別均在3級以上，且安格斯1號、安第斯、川農1號為5級，發病面積最為嚴重；多年生黑麥草均為2級嚴重度以下，受病害影響較小。

2.5 病情指數分析與抗性表現

發病初期，普通品種黑麥草的病情指數最高，為15.2，顯著高于其他9個黑麥草品種(P<0.05)；隨調查次數增加，一年生黑麥草各階段病情指數均顯著(P<0.05)高于多年生黑麥草(表4)。其中，一年生黑麥草隨調查次數增加，川農1號病情指數增長速度較其他5個品種快，在第15 d到達峰值，為79.7，顯著(P<0.05)高于其他5個多年黑麥草；多年生黑麥草品種中，隨發病時間延長，病情指數上升緩慢。

表4 黑麥草品種病情指數與抗性分析

按照抗性分級標準分析，川農1號、安格斯1號、安第斯、普通4個一年生黑麥草品種對灰梨孢灰斑病表現為高感(HS)，從發病初期到發病后期，4個品種的病情指數上升最快；杰威為中感(MS)，長江2號為中抗(MR)；紳士、首相、紐怡、維多利亞4個品種病情指數各階段均在5以下，達到高抗(HR)水平，病情指數隨調查時間的增加變化幅度小，4個品種之前的病情指數無顯著差異(P<0.05)。

3 討論

黑麥草灰梨孢灰斑病為近年來流行較廣的真菌性病害[20-21]，水稻稻瘟病病原菌同灰梨孢灰斑病病原菌同屬梨孢霉屬，兩者發病條件相似，均在高溫高濕環境下利于發病，各個部位均可發病[22-25]。薛福祥等[8]的研究表明，在濕度較高的環境下，植株被侵染后48 h便會迅速枯萎，3～5 d就可以導致易感黑麥草大田被毀滅殆盡，與本研究的情況一致。據調查，成都、綿陽、眉山、遂寧、資陽、南充等地區該病均有發生，一般是在播種后1個月時間內嚴重發生，造成的損失非常巨大。因此，加強黑麥草灰梨孢灰斑病早期(一般是分蘗初期最佳)防控十分必要。多年生黑麥草的抗性較強，但多花黑麥草對灰梨孢灰斑病的抗性較差，原因可能是多花黑麥草前期的生長速度較快，營養體比較豐富，葉面積大，易于受到病害侵染，二者表現出明顯的抗性差異，應在其致病機理上進一步探討。

本次試驗用平均嚴重度和病情指數兩個指標對黑麥草灰梨孢灰斑病分別進行抗性分級，其大多數結果大體一致，但對杰威、長江2號和普通3個品種有一些差異?；依骀呋野卟鞑パ杆伲：χ兀壳皼]有針對性的評價方法和判斷指標，而不同方法對黑麥草灰梨孢灰斑病抗性評價可能會出現偏差，會影響結果判斷，因此，在對梨孢霉屬真菌的抗性分級方法上應做進一步的有針對性的研討，為抗性選育和防治提供更為科學的依據。

本次試驗為盆栽模擬性試驗，可以為大田試驗提供一定依據，其結果對生產上的防治具有積極的指導意義，在防治上應優先選用抗病品種，并加強做好早期防控。

本次試驗為接菌試驗，盆栽植物生長環境與大田有一定大的差異，其發病與大田植物自然發病情況應有所不同，應結合大田試驗對結果進一步進行效驗完善。

4 結論

參試品種中多年生黑麥草維多利亞、紳士、首相、紐怡對灰梨孢灰斑病顯示出高抗(R)，且4個品種間無顯著差異，而多花黑麥草川農1號、安格斯1號、安第斯對灰梨孢灰斑病顯示出高感(S)，3個品種差異不顯著。